柚皮素对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和转移能力的影响

贾　淼， 师阿盟， 史海涛， 王　燕， 董　蕾， 郭晓燕

(西安交通大学第二附属医院消化内科，陕西省胃肠动力疾病研究重点实验室，陕西省胃肠疾病临床研究中心，西安　710004；*通讯作者，E-mail:shihaitao7@163.com)



柚皮素对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和转移能力的影响

贾淼， 师阿盟， 史海涛*， 王燕， 董蕾， 郭晓燕

(西安交通大学第二附属医院消化内科，陕西省胃肠动力疾病研究重点实验室，陕西省胃肠疾病临床研究中心，西安710004；*通讯作者，E-mail:shihaitao7@163.com)

目的探讨柚皮素对人胃癌SGC-7901细胞增殖、黏附、侵袭及迁移能力的影响。 方法选用不同浓度柚皮素(100,200,400 μmol/L)干预人胃癌细胞株SGC-7901，并设立对照组(未经柚皮素处理)，采用MTT 法检测细胞增殖及黏附能力；采用Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力；采用real-time PCR及Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及蛋白表达变化。结果① 柚皮素干预胃癌细胞24 h后，增殖能力无明显变化；而干预48 h及72 h后，胃癌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。② 200及400 μmol/L柚皮素可明显降低胃癌细胞的黏附、侵袭及迁移能力(P<0.05)，而100 μmol/L柚皮素仅能降低胃癌细胞的迁移能力(P<0.05)，但对黏附及侵袭能力无明显影响。③ 柚皮素可明显降低胃癌细胞内MMP-2及MMP-9的表达(P<0.05)，但对VEGF的表达无明显影响。结论柚皮素可抑制胃癌细胞的增殖、黏附、侵袭及迁移能力，这可能与其下调MMP-2及MMP-9表达有关。

柚皮素；胃癌；SGC-7901细胞；细胞增殖；细胞转移

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤死亡率中排名第二。胃癌的临床症状缺乏特异性，因此发现时多已进入中晚期。中晚期胃癌的手术效果欠佳，而化疗因其较大的毒副作用导致患者不能耐受，新近研究的生物治疗亦因价格昂贵以及效果不明确等原因限制了其广泛应用[1]。随着中药现代化、药理分析技术及分子生物技术的发展，中药以及各种植物成分在肿瘤治疗中的作用逐渐受到重视[2]。柚皮素(naringenin)是存在于植物中的一种黄酮类化合物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、降脂及抗癌活性[3-7]。关于其抗癌作用，有研究报道其可通过增强免疫系统对癌细胞的杀伤作用来发挥抗癌能力，但又有研究发现柚皮素可直接发挥抗癌作用，这在肝癌[7]、胰腺癌[8]、结肠癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11]等肿瘤中已有相关研究，但其对胃癌细胞的作用尚不十分清楚。研究发现进展期胃癌治疗效果欠佳的原因之一便是肿瘤转移，许多患者并非死于原发灶而是死于转移灶[1]。因此，本实验旨在探讨柚皮素对人胃癌SGC-7901细胞增殖及转移能力的影响，为其临床应用提供理论及实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞株及主要试剂

人胃癌SGC-7901细胞株(购自中科院上海细胞生物研究所)；柚皮素、MTT、DMSO(Sigma，美国)；RPMI1640(Hyclone，美国)；胎牛血清(浙江杭州天航生物科技有限公司)；Transwell小室、96孔板及24孔板(Costar，美国)；基质胶(Matrigel)(BD公司，美国)；RNA提取试剂盒Fastgen200(上海飞捷生物技术有限公司)；逆转录试剂盒(Fermentas，美国)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara生物工程有限公司)；总蛋白提取试剂盒(陕西先锋生物有限公司，中国)；兔抗人β-actin、MMP-2、MMP-9及VEGF多克隆抗体(Proteintech，美国)；HRP标记山羊抗兔IgG(Bioworld，美国)。

1.2柚皮素的制备

柚皮素溶解于DMSO中，再用无血清的RPMI 1640稀释为100,200,400 μmol/L。

1.3细胞培养及分组

人胃癌细胞SGC-7901于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、含5% CO2饱和湿度培养箱中培养，2-3 d后0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。实验分4组：对照组(未经柚皮素处理)、实验组(柚皮素浓度分别为100，200，400 μmol/L)。

1.4细胞增殖实验

人胃癌细胞SGC-7901胰酶消化后用含10%胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度至3×104/ml，接种于96孔板，每孔200 μl，每组5个复孔，经各组药物干预，分别培养24，48，72 h后每孔加入MTT 20 μl，孵育4 h后弃去孔内培养液，加150 μl DMSO置摇床上振荡10 min，酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值(OD)。细胞增殖抑制率(%)=(阴性对照组OD值-柚皮素组OD值)/阴性对照组OD值×100%。

1.5细胞黏附实验

将基质胶Matrigel用不含血清的冷RPMI1640按1∶5稀释，96孔板中每孔100 μl，室温干燥过夜。胃癌细胞经柚皮素干预48 h后，接种于含Matrigel的96孔板中，每孔10 000个细胞，每组5个复孔，以培养液作为空白对照调零组，置于培养箱内孵育。3 h后用PBS溶液冲洗，每孔加入MTT 20 μl，培养4 h后吸去孔内培养液。每孔加入150 μl DMSO，置摇床上振荡10 min。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值(OD)。

1.6细胞侵袭及迁移实验

将基质胶Matrigel用不含血清的冷RPMI1640按1∶5稀释，取100 μl加到24孔Transwell上室中，室温干燥过夜以重建基底膜。胃癌细胞经柚皮素干预48 h后进行实验，用含5%胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度到1×105/ml。24孔板Transwell小室上室加200 μl细胞悬液，下室加600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640作为趋化液，每组设3个小室。37 ℃培养箱孵育24 h后用棉签擦去滤膜内表面未穿过的细胞，外表面采用结晶紫染色，取5个视野(上、中、下、左、右)照相并计数，实验重复3次。细胞迁移实验除不铺Matrigel外，其余步骤同侵袭实验。1.7real time-PCR检测MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA表达

柚皮素干预胃癌细胞48 h后，采用Fastgen试剂盒提取细胞总RNA。cDNA合成按照Fermentas逆转录试剂盒操作说明提取。引物设计及合成以NCBI Genebank中提供的人类基因序列行MMP-2、MMP-9、VEGF、β-actin的引物设计，由Takara生物工程(大连)有限公司合成。MMP-2(NM_001302510.1)：上游5′-TTGGTGGGAACTCAGAAGG-3′，下游5′-CTTGCGGTCATCATCGTA-3′；MMP-9(NM_004994.2)：上游5′-TGACAGCGACAAGAAGTG-3′，下游5′-CAGTGAAGCGGTACATAGG-3′；VEGF(NM_001287044.1)：上游5′-CGGCGAAGAGAAGAGACACATTG-3′，下游5′-CGGGAAGGGAAGGGAAGGAC-3′；β-actin(NM_001101.3)：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3′。反应体系包括模板cDNA 1 μl， 上游引物(10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ddH2O 7 μl，置于荧光定量PCR仪中进行扩增，反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；共40个循环。PCR反应结束后，将PCR反应液温度自60 ℃至95 ℃缓慢升温，实时监测SYBR GreenⅠ的荧光信号强度变化，获取融解曲线，以确认PCR反应的特异性。目的基因相对表达水平参考文献[11]为2-ΔΔCt= 2-(ΔCta-ΔCtb)，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，a、b分别代表两组样本，其中a代表实验组，b代表对照组，Ct为根据扩增曲线确定的扩增循环数。

1.8Western blot检测MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表达

药物干预48 h后，按照总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，加上样缓冲液，在聚丙稀酰胺凝胶中电泳，将蛋白电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后分别与抗β-actin、抗MMP-2、抗MMP-9、抗VEGF多克隆抗体孵育，再与相应的二抗反应，阳性条带用化学发光法检测。结果用Gel-pro分析软件进行分析，计算目的蛋白与相应内参的光密度比值。

1.9统计学分析

2　结果

2.1柚皮素对胃癌细胞增殖能力的影响

采用MTT法检测细胞增殖能力，活细胞数目越少，OD值越小。由表1可以看出，与对照组相比，柚皮素干预胃癌细胞24 h后，SGC-7901细胞增殖无明显变化；而柚皮素干预48 h和72 h后，100，200，400 μmol/L柚皮素均可明显抑制胃癌细胞的增殖(P<0.05)，且随着浓度的增加及干预时间的延长，细胞增殖抑制率亦明显增加，其中400 μmol/L柚皮素干预胃癌细胞72 h后细胞增殖抑制率达35.3%。

2.2柚皮素对胃癌细胞黏附的影响

采用MTT法检测黏附于96孔板内Matrigel的细胞数，细胞数越少，OD值越小。由表2可以看出，与对照组相比，100 μmol/L柚皮素组OD值无明显变化，而200，400 μmol/L柚皮素组OD值明显减小，提示黏附于Matrigel的胃癌细胞数明显减少(P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌细胞的黏附能力。

表1柚皮素对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响

Table 1Effect of naringenin on the proliferation capacities of gastric cancer SGC-7901 cells

时间对照组OD值100μmol/L柚皮素组200μmol/L柚皮素组400μmol/L柚皮素组OD值抑制率(%)OD值抑制率(%)OD值抑制率(%)24h0.486±0.0360.479±0.0310.20.457±0.0464.80.428±0.04010.948h0.681±0.0370.606±0.016*11.10.587±0.032*13.90.503±0.051*25.372h0.879±0.0430.749±0.032*14.80.654±0.039*25.60.569±0.051*35.3

与对照组比较，*P<0.05

2.3柚皮素对胃癌细胞侵袭能力的影响

采用Transwell小室检测细胞侵袭能力，胃癌细胞需水解Matrigel穿过基膜，穿过的细胞数越多，表明侵袭能力越强。由表2及图1可以看出，与对照组比较，100 μmol/L柚皮素组细胞数无明显变化，而200，400 μmol/L柚皮素组穿膜细胞数明显减少 (P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌细胞的侵袭能力。

2.4柚皮素对胃癌细胞迁移能力的影响

采用不铺Matrigel的Transwell小室检测细胞迁移能力，穿过的细胞数越多，表明迁移能力越强。由表2及图2可以看出，与对照组比较，100，200，400 μmol/L柚皮素组穿膜细胞数均明显减少(P<0.05)，表明柚皮素可降低胃癌细胞的迁移能力。

表2柚皮素对胃癌SGC-7901细胞黏附、侵袭及迁移能力的影响

Table 2Effect of naringenin on the adhesive, invasive and migratory capacities of gastric cancer SGC-7901 cells

组别黏附能力(OD值)侵袭能力(穿膜细胞数,个)迁移能力(穿膜细胞数,个)对照组0.539±0.016283.89±27.28332.78±20.55100μmol/L柚皮素0.503±0.031268.33±33.02282.89±42.31*200μmol/L柚皮素0.435±0.033*207.78±30.00*223.22±28.38*400μmol/L柚皮素0.408±0.042*121.22±24.94*145.56±27.30*

与对照组比较，*P<0.05

2.5柚皮素对胃癌细胞MMP-2、MMP-9 及VEGF表达的影响

采用real-time PCR及Western blot检测柚皮素对胃癌细胞内MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA及蛋白表达的影响，由图3、4可以看出，与对照组相比，100,200,400 μmol/L柚皮素组胃癌细胞内MMP-2的表达均明显下降(P<0.05)，而MMP-9的表达仅在200及400μmol/L组明显下降(P<0.05)，100 μmol/L柚皮素对MMP-9的表达无明显影响。不同浓度的柚皮素对VEGF的表达均无明显影响。

A.对照组　　　　　B.100 μmol/L柚皮素　　　C.200 μmol/L柚皮素　　D.400 μmol/L柚皮素　　　图1　柚皮素对胃癌SGC-7901细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×200)Figure 1　Effect of naringenin on the invasive capacities of gastric cancer SGC-7901 cells (×200)

A.对照组　　　　　B.100 μmol/L柚皮素　　　C.200 μmol/L柚皮素　　D.400 μmol/L柚皮素　　　图2　柚皮素对胃癌SGC-7901细胞迁移能力的影响 (结晶紫染色，×200)Figure 2　Effect of naringenin on the migratory capacities of gastric cancer SGC-7901 cells (×200)

图3　柚皮素对胃癌SGC-7901细胞内MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表达的影响Figure 3　Effect of naringenin on protein expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF in gastric cancer SGC-7901 cells

图4　柚皮素对胃癌SGC-7901细胞内MMP-2、MMP-9 及VEGF mRNA表达的影响Figure 4　Effect of naringenin on mRNA expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF in gastric cancer SGC-7901 cells

3　讨论

随着中药现代化研究的发展，人们逐渐认识到中药在肿瘤治疗中的作用及机制。相比于西药，中药具有毒性低、价格便宜的优势，中药及其具体成分抗癌作用的阐明也提示其在肿瘤预防中的重要性。中药除了直接的抗癌作用如抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞转移等，还可通过调节免疫间接发挥抗肿瘤作用[2]。柚皮素是柚皮甙的甙元，属于二氢黄酮类化合物，研究发现其同时具备直接和间接抗癌作用。关于其抗癌机制，Arul等[7]发现柚皮素可通过阻断细胞周期抑制细胞增殖，并诱导凋亡发挥抗肝癌作用。Lou等[8]发现柚皮素可通过抑制TGF-β诱导的上皮间质转化以及降低MMP-2、MMP-9表达抑制胰腺癌细胞的转移。Li等[9]发现柚皮素可通过抑制COX-1的表达抑制结肠癌细胞生长。Jin等[10]发现柚皮素可通过上调死亡受体5从而增加TRAIL诱导的肺癌细胞凋亡。Abaza等[11]发现柚皮素可通过阻断细胞周期并调节Akt及NF-κB信号通路等抑制乳腺癌细胞的增殖。综上所述，柚皮素具有抗癌作用已经被初步证实，但其对胃癌的作用尤其是胃癌转移的影响及机制尚不十分清楚，本研究初步探讨了柚皮素对胃癌细胞增殖和转移能力的影响及可能的分子机制。

肿瘤细胞的增殖与凋亡决定着癌症的进展，但其转移能力无疑与疾病的预后密切相关，无论早期肿瘤还是进展期肿瘤，控制转移都显得尤为重要。针对肿瘤转移机制及抗转移药物的研究倍受关注。肿瘤转移的基本过程包括原发肿瘤的增殖、肿瘤细胞的黏附、侵袭、迁移、新生血管、转移癌灶的形成。肿瘤细胞不断增殖导致组织内部压力增高，癌细胞间黏附降低，而与细胞外基质间的黏附增加，并在各种水解酶的作用下降解细胞外基质，然后向血管或淋巴管侵入，随即穿出血管到达靶器官可形成微小转移灶，新生血管的生成将使得转移灶不断增殖，当增殖到一定大小又开始向别处转移[12]。由此可见，肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭、迁移及血管生成能力在肿瘤转移过程中具有重要的作用，也是许多抗肿瘤转移药物作用的靶点。本实验在体外采用基质胶Matrigel模拟细胞外基质，并结合Transwell小室模拟胃癌细胞的黏附、侵袭及迁移过程，结果提示柚皮素可明显抑制胃癌转移过程中的增殖、黏附、侵袭及迁移能力，表明柚皮素可能具有抗胃癌转移的作用，但其机制如何，尚需进一步研究。既往的研究发现在肿瘤转移过程中，基质金属酶(MMPs)起着至关重要的作用。MMPs是锌离子依赖的内分泌蛋白酶，主要参与细胞间黏附调节、细胞外基质的降解和新血管的形成[13]。目前发现MMPs家族成员达20多种，其中MMP-2和MMP-9主要降解Ⅳ型胶原蛋白，在多种肿瘤组织包括胃癌中高表达，对肿瘤细胞的黏附、侵袭和迁移过程发挥着重要的作用[14,15]。VEGF是一种血管生成因子，可以通过促进肿瘤血管生成和重建为肿瘤的生长提供营养，同时可以使血管通透性增加，为肿瘤的浸润转移提供有利的条件[16]。因此，本实验为明确柚皮素抑制胃癌细胞转移的机制，进一步研究了其对胃癌细胞内MMP-2、MMP-9及VEGF的影响，结果提示柚皮素可明显抑制胃癌细胞内MMP-2及MMP-9的表达，但对VEGF的表达无明显影响，提示柚皮素可能通过抑制MMP-2及MMP-9抑制胃癌细胞的黏附、侵袭及迁移，但却对血管生成中最重要的因子VEGF表达无明显影响，因此，柚皮素是否可影响胃癌的血管生成尚需进一步更深入的研究。

综上所述，本研究从胃癌转移的过程入手，探讨了柚皮素对胃癌细胞转移能力的影响及机制，结果表明柚皮素在体外可明显抑制胃癌细胞的增殖、黏附、侵袭及迁移能力，并可降低胃癌细胞内MMP-2及MMP-9的表达，但对VEGF的表达无明显影响。本研究结果进一步揭示了柚皮素的抗癌作用，尤其是其对胃癌细胞转移能力的抑制作用，从而为胃癌的综合治疗提供了新的方向。

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Effect of naringenin on the proliferative and metastatic capacities of human gastric cancer SGC-7901 cells

JIA Miao, SHI Ameng, SHI Haitao*, WANG Yan, DONG Lei, GUO Xiaoyan

(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiKeyLaboratoryofGastrointestinalMotilityDisorders,ShaanxiClinicalResearchCenterofGastrointestinalDisease,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:shihaitao7@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of naringenin on the proliferative, adhesive, invasive and migratory capacities of human gastric cancer SGC-7901 cells.MethodsSGC-7901 cells were treated with different concentrations of naringenin(0,100,200,400 μmol/L). Then the cell proliferative and adhesive capacities were measured by MTT assay, and the cell invasive and migratory capacities were determined by Transwell assay. The mRNA and protein expression levels of metalloproteinase-2(MMP-2), MMP-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in gastric cancer cells were detected by real-time PCR and Western blot.Results①Naringenin had no effect on cell proliferation after 24 h treatment. However, the proliferative capacity of SGC-7901 cells was inhibited significantly when treated with naringenin for 48 h and 72 h(P<0.05). ②The 200 and 400 μmol/L naringenin significantly inhibited adhesive, invasive and migratory capacities of SGC-7901 cells(P<0.05). The 100 μmol/L naringenin only inhibited cell migratory capacity(P<0.05), but had no effect on adhesive and invasive capacities. ③Naringenin effectively down-regulated the mRNA and protein expression of MMP-2 and MMP-9(P<0.05), but had no effect on VEGF expression.ConclusionThese findings suggest that naringenin could inhibit the proliferative, adhesive, invasive and migratory capacities of SGC-7901 cellsinvitro, which may be related to the inhibition of the expression of MMP-2 and MMP-9.

naringenin;gastric cancer;SGC-7901 cell;cell proliferation;cell metastasis

国家星火计划资助项目(2011GAB50001)

贾淼，女，1979-05生，本科，住院医师，E-mail：xiaomao7954@sohu.com

2015-12-21

R735.2

A

1007-6611(2016)03-0218-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.006