氟在内质网应激引起原代培养成釉细胞自噬与凋亡中的作用

王　琳， 王丹杨， 王　峰， 谢　娜

(西安医学院口腔医学系，西安　710021；*通讯作者，E-mail：815365619@qq.com)



氟在内质网应激引起原代培养成釉细胞自噬与凋亡中的作用

王琳*， 王丹杨， 王峰， 谢娜

(西安医学院口腔医学系，西安710021；*通讯作者，E-mail：815365619@qq.com)

目的探讨氟在内质网应激引起原代培养成釉细胞自噬与凋亡中的作用及相关机制。方法分离SD大鼠上下颌磨牙牙胚中的成釉细胞进行原代培养。待细胞生长稳定后，采用0.8 mmol/L、1.6 mmol/L NaF分别干预体外培养成釉细胞24 h和48 h，倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及其超微结构。1.6 mmol/L NaF作用于成釉细胞24 h和48 h，利用real-time PCR和Western blot法分别检测不同时间点下成釉细胞XBP1s mRNA、GRP78和CHOP蛋白的表达水平。结果倒置显微镜下观察，0.8 mmol/L NaF干预成釉细胞24 h和48 h，与对照组相比均未见明显差异。1.6 mmol/L NaF作用于成釉细胞48 h凋亡细胞数明显多于同浓度氟作用于细胞24 h时。透射电镜结果显示，NaF干预成釉细胞24 h，0.8 mmol/L NaF组细胞粗面内质网池样扩张，线粒体肿胀，体积增大，电子密度降低，溶酶体丰富，自噬样结构可见。1.6 mmol/L NaF 组细胞内自噬样结构明显增加。1.6 mmol/L NaF作用下，成釉细胞内质网应激相关蛋白XBP1s mRNA、GRP-78及CHOP蛋白表达水平48 h时间点较24 h 时间点均明显增加(P<0.01)。结论氟可导致成釉细胞内质网应激，启动自噬，随着氟处理时间延长，激活凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。

氟；成釉细胞；内质网应激；自噬；细胞凋亡

牙齿发育期间摄入过量的氟会影响釉质的形成，导致氟牙症。成釉细胞是釉质发育过程中的主要细胞[1]。有研究表明，高剂量的氟会引起成釉细胞内质网应激[2,3]。内质网是细胞膜蛋白和分泌蛋白加工成熟的主要场所[4]，在应激状态下会失去正确折叠的能力而导致未折叠或错误折叠蛋白的累积，进一步激活未折叠蛋白反应 (unfolded protein response,UPR)，促进内质网对蓄积在网腔内的未折叠或错误折叠蛋白质的降解[5]或自噬[6]，以维持细胞内稳态。

自噬是一种高度调节代谢过程，在许多细胞活动包括发育、分化、存活和维持内稳态都是至关重要的[7]。内质网应激-自噬可以维持细胞内环境的稳态平衡，具有一定的保护性作用。内质网应激时未折叠蛋白反应可以激活自噬，自噬又可以通过降解错误折叠或未折叠蛋白减轻内质网的负荷，抑制内质网应激的过度激活，同时产生的降解产物也为机体细胞新蛋白质的合成、细胞结构的重建以及ATP的生成提供原料。但过度激活的内质网应激-自噬又能够加重细胞损伤，甚至导致细胞死亡[8]。

本研究将氟化钠(NaF)作用于体外培养的大鼠原代成釉细胞(ameloblast)，探讨氟在内质网应激引起成釉细胞自噬与凋亡中的作用及相关机制。

1　材料和方法

1.1实验动物

4 d龄同批次SD大鼠(西安交通大学医学部动物实验中心提供)。

1.2主要试剂和仪器

DMEM高糖培养基(HyClone公司，美国)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(HyClone公司，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(Sigma公司，美国)；胰酶(Sigma公司，美国)；兔抗大鼠细胞角化蛋白14(cytokeratin14，CK14)单克隆一抗、兔抗大鼠成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)单克隆一抗、免疫组化SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)一抗、小鼠抗大鼠C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)一抗(cell signaling公司，美国)；各型号培养板、培养瓶、离心管(Corning公司，美国)，Lab-TekTM腔室载玻片(NUNC公司，美国)等。

1.3原代成釉细胞的培养

4 d龄SD大鼠，脱颈处死，用75%乙醇浸泡10 min。无菌条件下解剖分离双侧上下颌骨内磨牙牙胚，用含1%青-链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗。将牙胚组织切碎，1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入2.5 mg/LⅠ型胶原酶(含1% BSA)，37 ℃水浴箱内消化1 h，适度吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤，再次离心，弃上清，之后用新鲜配置的胰蛋白酶消化5 min，加入DMEM培养液终止消化。1 000 r/min离心5 min，弃上清，DMEM培养液洗涤后再次离心弃上清，加入含17% FBS的DMEM高糖培养液，将所有细胞悬液转移至多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中。置饱和湿度、含5% CO2的37℃培养箱中培养。首次72 h换液，以后每48 h换液。待单层细胞生长到覆盖瓶底的80%时，胰蛋白酶消化，将细胞转置6孔板及Lab-TekTM腔室载玻片内，继续培养，每48 h换液1次，待细胞状态稳定后，进行细胞鉴定及指标检测。培养期间进行形态学观察。

1.4成釉细胞的鉴定

将成釉细胞接种于腔室载玻片的腔室内，细胞接种密度为1×104/ml，待细胞生长稳定后，95%乙醇固定细胞10 min，按照二步法抗兔/鼠通用型免疫组织化学检测试剂盒说明书进行细胞角蛋白CK14和AMBN染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.5氟干预成釉细胞及形态观察

待成釉细胞生长稳定后，分别加入NaF浓度为0.8 mmol/L、1.6 mmol/L的含氟培养液，对照组为不含氟培养液。培养24 h、48 h，倒置显微镜下进行细胞形态学观察。

1.6氟作用下成釉细胞的超微结构观察

待成釉细胞生长稳定后，分别加入NaF浓度为0.8 mmol/L、1.6 mmol/L的含氟培养液，对照组为不含氟培养液。培养24 h，1 500 r/min离心10 min、固定及常规处理，透射电镜下进行细胞超微结构观察。

1.7实时定量PCR(real-time PCR)检测XBP1s mRNA表达

成釉细胞经1.6 mmol/L NaF分别处理24 h和48 h，收集细胞，按照RNeasy试剂盒的说明书提取细胞总RNA，Nanodrop 2000测量RNA的浓度，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照Starr等[9]条件将反转录产物用于real-time PCR检测剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1 spliced，XBP1s)mRNA的表达。GAPDH为内对照。所用引物如下：GAPDH 正向5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；GAPDH 反向5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；XBP1s 正向5′-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3′；XBP1s 反向5′-GCTGGCAGGCTCTGGGGAAG-3′。

1.8蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白含量

成釉细胞经1.6 mmol/L NaF分别处理24，48 h，收集细胞并提取蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质样品经SDS-PAGE 电泳分离,转至硝酸纤维素膜,室温条件下5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入含 5% BSA稀释液稀释的GRP78、CHOP和β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，加入稀释的相应二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h。洗膜后用 ECL显色，化学发光拍照，用软件进行图像灰度值分析。

1.9统计学分析

数据分析采用SigmaStat V3.5统计软件。多组样本间均数比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，检测水准为双侧α=0.05。

2　结果

2.1原代培养成釉细胞形态

当细胞密度较低时，倒置显微镜下成釉细胞边界整齐，呈多角形(图1A)；当细胞数量较多时，成釉细胞间连接紧密，细胞呈铺路石样(图1B)。细胞核明显，细胞质内有蛋白样物质。提示培养的细胞具有上皮来源细胞的典型形态特征。

2.2成釉细胞的免疫组织化学鉴定

免疫细胞化学染色显示，AMBN和CK14表达呈阳性(图2)，且主要分布于细胞质内，提示培养的细胞为上皮来源并具有合成AMBN的功能，符合成釉细胞组织免疫学特征。

A. 低细胞密度　　　　　　　　　　　　　 B.高细胞密度图1　原代培养大鼠成釉细胞形态 (×10)Figure 1　Morphology of primary rat ameloblast under inverted phase contrast microscope (×10)

A. 阴性对照　　　　　　　B.AMBN染色(+)　　　　　　　C.CK14染色图2　免疫组化显示AMBN和CK14在大鼠成釉细胞中的表达 (×10)Figure 2　Expression of CK14 and AMBN in rat ameloblast by IHC (×10)

2.3氟干预下成釉细胞形态学观察

倒置显微镜下观察不同浓度氟作用于成釉细胞不同时间细胞的形态及生长情况。对照组为不含氟培养液培养24，48 h，细胞呈多角形贴壁生长，突触明显(见图3A，3B)。0.8 mmol/L NaF干预细胞24 h(见图3C)、48 h(见图3D)，与对照组相较未见明显差异。1.6 mmol/L NaF干预细胞24 h，成釉细胞体积缩小，突触变短，期间有少量凋亡细胞存在(见图3E)。48 h时，部分细胞缩小、变圆，凋亡细胞增多(见图3F)。

2.4氟干预下成釉细胞超微结构观察

对照组：培养细胞略呈圆形，表面可见少量的微绒毛样突起；细胞核形状不规则，核内染色质分布均匀，常染色质丰富，少量异染色质沿核膜分布，核仁常见；细胞质内细胞器丰富，粗面内质网短管状，部分粗面内质网池样扩张，线粒体圆形或杆状，线粒体嵴结构清晰，初级及次级溶酶体丰富，电子密度较高，可见少量自噬样结构(见图4A)。

0.8 mmol/L NaF干预组：培养细胞体积较大，形态不规则；细胞核内常染色质丰富，核仁可见；细胞质内粗面内质网池样扩张，线粒体肿胀，体积增大，电子密度降低，溶酶体丰富，可见自噬样结构(见图4B)。

1.6 mmol/L NaF干预组：部分培养细胞肿胀、坏死，细胞膜断裂，连续性消失，细胞质内可见到自噬样结构明显增加，可见凋亡细胞(见图4C)。

图3　氟干预下成釉细胞的形态观察 (×10)Figure 3　Morphology of ameloblast after treated with NaF (×10)

A.对照组　　　　　　　　B.0.8 mmol/L NaF组　　　　　　C.1.6mmol/L NaF组　图4　氟干预下成釉细胞的超微结构观察Figure 4　Changes of ultrastructures of ameloblast after treated with NaF

2.5氟引起成釉细胞内质网应激

1.6 mmol/L NaF分别处理成釉细胞24，48 h，qRT-PCR显示24，48 h组XBP1s mRNA 表达水平显著高于对照组(见图5)，差异具有统计学意义(P<0.01)；Western blot显示24 h组、48 h组GRP-78 和CHOP蛋白质水平显著提高(见图6)，且表达随着处理时间的延长而增加。

3　讨论

原代培养大鼠成釉细胞较好地保存了原组织细胞的遗传特征和生物学特性，是研究氟作用下成釉细胞的各种功能变化及氟斑牙发生相关分子机制的理想模型[10]。近年来发现在氟斑牙的形成过程中，内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERs)发挥着重要的作用[11]。当细胞内质网处于应激状态，会产生大量的错误折叠蛋白，而蛋白质的降解对于维持细胞内环境的稳定是十分重要的，自噬过程通过降解长周期蛋白和损伤的细胞器，来清除细胞内的垃圾[12]。自噬发生时，细胞质内出现大量的双层膜性结构，包裹即将被降解的蛋白质或细胞器，形成自噬小体。自噬小体形成后即被运送到液泡或溶酶体中被降解，其中的物质被循环利用。这一过程可以协助细胞在各种压力胁迫状态下得到缓解。

与对照组比较，**P<0.01图5　氟对成釉细胞XBP1s mRNA表达影响Figure 5　Effect of fluoride on XBP1s mRNA levels in ameloblast

图6　氟对成釉细胞GRP-78和CHOP蛋白表达水平的影响Figure 6　Effect of fluoride on GRP-78 and CHOP protein levels in ameloblast

本研究通过不同浓度的NaF作用于原代大鼠成釉细胞，观察氟对成釉细胞形态及超微结构的影响。透射电镜结果显示，0.8 mmol/L NaF组与对照组相较，细胞粗面内质网池样扩张，线粒体肿胀，体积增大，电子密度降低，溶酶体丰富，可见自噬样结构。1.6 mmol/L NaF组自噬样结构明显增加，表明自噬被活化。通过倒置显微镜观察，1.6 mmol/L NaF作用于成釉细胞48 h时，凋亡细胞数明显多于同浓度氟作用于细胞24 h时。

近年研究发现，过量的氟作用于成釉细胞，首先引起ERs，进而导致UPR[11]。UPR通过启动自噬清除错误折叠蛋白，维持内质网稳态，保护细胞减轻外界刺激损伤，使细胞存活[13]；而当这种应激刺激延长达到一定的时间点时，UPR可能会促进凋亡信号途径的活化[12]。

Caspase-12是介导ERS凋亡的关键分子，活化的caspase-12激活 caspase 家族的caspase-9、caspase-3 等，引起caspase介导的细胞凋亡[14]。UPR启动后可引起一系列的分子改变，包括内质网伴侣蛋白GRP78/Bip、Calnexin、GRP94等的表达增加，CHOP表达增加，以及XBP1 mRNA的剪切等。GRP78/Bip参与并监控蛋白质折叠；CHOP则可以抑制 Bip和Bcl-2的表达，促进细胞凋亡[14]。Kubota 等[11]发现，过量氟能导致 LS8 细胞内内质网伴侣分子 GADD153、GRP-78、XBP-1 等的表达量升高。这些都为在氟斑牙的形成过程中，氟介导ERs并激活UPR提供了有力依据。本实验通过对 XBP1s mRNA 和GRP78/Bip和CHOP蛋白水平检测，结果表明随着1.6 mmol/L NaF干预成釉细胞时间延长，XBP1s mRNA表达升高，GRP-78/Bip和CHOP蛋白表达量亦随之升高，进一步验证了在氟斑牙的形成过程中，过量氟导致了ERs并激活了UPR，并有可能通过激活内质网凋亡途径引起成釉细胞凋亡。

综上所述，本研究应用不同浓度的NaF作用于原代培养的成釉细胞，观察其对细胞的影响。研究结果表明，氟可导致ERs，并进一步激活UPR，启动自噬，ERs和自噬通过相互调控发挥保护性的作用，维持细胞内环境的稳态，当氟浓度达到一定水平或处理时间延长后，UPR不足以维持ER稳态, 细胞启动由 ERs 所介导的凋亡信号通路，最终诱导细胞凋亡。

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Roles of fluoride in autophagy and apoptosis of primary rat ameloblasts induced by endoplasmic reticulum stress

WANG Lin*，WANG Danyang，WANG Feng，XIE Na

(DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;*Correspondingauthor,E-mail: 815365619@qq.com)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of fluoride on endoplasmic reticulum(ER) stress-induced autophagy and apoptosis of primary rat ameloblastsinvitro.MethodsAmeloblasts were isolated from tooth germ of maxillomandibular molar and culturedinvitro. Ameloblasts were treated with 0.8 mmol/L and 1.6 mmol/L NaF for 24 h and 48 h, respectively. Cell morphology and ultrastructure were observed under phase contrast microscopy and TEM after the cell growth reached to a stable stage. After ameloblasts were treated with 1.6 mmol/L NaF for 24 h and 48 h,XBP1s mRNA levels, expression of GRP78 and CHOP proteins were measured by real-time PCR and Western blot at each time point.ResultsUnder the phase contrast microscope, the cell morphology showed no obvious difference after treated with 0.8 mmol/L NaF between 24 h and 48 h. After treated with 1.6 mmol/L NaF, the number of apoptotic cells statistically higher at 48 h than that at 24 h. The TEM results showed the extension of rough endoplasmic reticulum cistern, swelling of mitochondria, enlarged cell body, decreased electron density, increased lysosome, and appearance of autophagic structure after treated with 0.8 mmol/L NaF for 24 h. Compared with 0.8 mmol/L NaF group, autophagic structures increased in 1.6 mmol/L NaF group. After treated with 1.6 mmol/L NaF, ER stress-related XBP1s mRNA, GRP-78, and CHOP proteins were significantly higher at 48 h than that at 24 h (P<0.01).ConclusionThe results suggest that fluoride could cause ER stress of ameloblast and induce the autophagy, thus lead to apoptosis as the treatment continues.

fluoride；ameloblast；endoplasmic reticulum stress;autophagy;apoptosis

陕西省教育厅专项科研计划资助项目(2013JK0784)；西安医学院口腔临床医学重点建设学科支持项目

王琳，女，1980-04生，硕士，讲师，E-mail：815365619@qq.com

2016-01-11

R363

A

1007-6611(2016)03-0242-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.011