5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠残肾组织中HIF-1表达对贫血的影响

孙秀丽， 冯国徵， 侯国存， 雷震坤， 尚小梅

(包头市中心医院肾内科,包头　014040； *通讯作者，E-mail:btszbdf@163.com)



5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠残肾组织中HIF-1表达对贫血的影响

孙秀丽*， 冯国徵， 侯国存， 雷震坤， 尚小梅

(包头市中心医院肾内科,包头014040；*通讯作者，E-mail:btszbdf@163.com)

目的通过制作5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠模型，观察残肾组织中缺氧诱导因子-1(HIF-1)的表达对贫血的影响。方法雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠行5/6肾切除，随机分为假手术组、模型组(5/6肾切除)和促红细胞生成素(EPO)干预组。术后第3周，EPO组大鼠皮下注射重组人促红细胞生成素(rhEPO)40 IU/kg，每周2次，直到动物处死。实验动物分别于术后第90天处死，采集血液和留取残余肾组织标本，血液检测Scr及Hb，残余肾组织行HE染色和Masson染色观察病理变化；连续切片免疫荧光染色观察HIF-1在肾脏中的表达；Western blot印迹检测HIF-1的蛋白表达水平。结果①模型组残肾组织部分肾小球出现节段性硬化，肾间质局灶性纤维化，上皮萎缩，模型组与假手术组肾小球硬化指数相比明显升高(P<0.05)；模型组与EPO组肾小球硬化指数相比无明显差异(P>0.05)。②手术组与假手术组相比，Scr明显升高(P<0.05)，模型组与EPO组相比，Scr无显著差异(P>0.05)。③与假手术组比较，模型组Hb明显升高(P<0.05)；与模型组比较，EPO组Hb变化不明显(P<0.05)。④与假手术组比较，模型组HIF-1表达明显增加(P<0.05);与模型组相比，EPO组HIF-1表达明显减少(P<0.05)。结论在慢性肾衰竭大鼠中，HIF-1的表达增加可改善肾性贫血。

慢性肾衰竭；贫血；HIF-1；血红蛋白

[10]Jin CY,Park C,Hwang HJ,etal.Naringenin up-regulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAIL-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res,2011,55(2):300-309.

[11]Abaza MS,Orabi KY,Al-Quattan E,etal.Growth inhibitory and chemo-sensitization effects of naringenin,a natural flavanone purified from Thymus vulgaris,on human breast and colorectal cancer[J].Cancer Cell Int,2015,15(1):1-19.

[12]Su Z,Yang Z,Xu Y,etal.Apoptosis,autophagy,necroptosis,and cancer metastasis[J].Mol Cancer,2015,14(1):1-14.

[13]Cathcart J,Pulkoski-Gross A,Cao J.Targeting matrix metalloproteinases in cancer:bringing new life to old ideas[J].Genes Dis,2015,2(1):26-34.

[14]Alakus H,Grass G,Hennecken JK,etal.Clinicpathological significance of MMP-2 and its specific inhibitor TIMP-2 in gastric cancer[J].Histol Histopathol, 2008, 23(8):917-923.

[15]Chen SZ,Yao HQ,Zhu SZ,etal.Expression levels of matrix metalloproteinase-9 in human gastric carcinoma[J].Oncol Lett,2015,9(2):915-919.

[16]Aprile G,Ongaro E,Del Re M.Angiogenic inhibitors in gastric cancers and gastroesophageal junction carcinomas:A critical insight[J].Crit Rev Oncol Hematol,2015,95(2):165-178.

increased in model group(P<0.05). Compared with model group, the expression of HIF-1 decreased significantly in EPO group(P<0.05).ConclusionThe increasing expression of HIF-1 could improve the renal anemia in chronic renal failure rats.

近些年，虽然肾脏病的诊疗有了很大的发展，替代治疗也有进一步的提高，然而贫血仍然是造成慢性肾脏病患者死亡和病情加重的主要原因之一。贫血不仅影响慢性肾脏病患者的生活质量，而且增加心血管疾病发生和死亡的风险。虽然rhEPO(重组人促红细胞生成素)已广泛应用于肾性贫血治疗，但个体对药物的敏感性和剂量存在显著差异，约90%-95%的患者应用后，血红蛋白水平明显升高，然而约5%-10%的患者应用后不能达到目标值，即出现促红细胞生成素抵抗，严重影响患者的寿命，因此，从基因水平或内源诱导促红细胞生成素增加是很有必要的，而许多研究发现HIF-1的靶基因为EPO编码基因[1-3]。因此，我们推测HIF-1可能在基因水平诱导内源性促红细胞生成素方面起重要作用，从而对重组促红细胞生成素抵抗患者贫血的改善方面起重要作用，所以本研究从此方面着手进行相关研究。

1　材料与方法

1.1实验动物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体重(250.0±20.0)g，内蒙古大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(蒙2002-0001)。

1.2主要仪器与试剂

MICROS-60血细胞分析仪(法国ABX公司)；CX9全自动生化分析仪(美国Beckman公司)；HITACHl7180全自动生化仪(日本HITACHl公司)；Rabbit Anti-HIF-1(北京博奥森生物技术有限公司)；FITC标记的山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；5%BSA封闭液(武汉博士德生物工程有限公司)；正常山羊血清工作液和辣根酶标记链酶卵白素工作液(S-A/HRP)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3动物模型的制作及分组

根据参考文献[4,5]，通过两步法进行5/6肾切除，两次手术前后相隔一周。适应性喂养1周后，大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射，20 min左右麻醉后俯卧位固定、局部剪毛、常规皮肤消毒，行左侧斜向外下方(肾区)切口3-4 cm，充分暴露左侧肾脏，剥离肾包膜，先夹闭肾脏上下极，待夹闭区域因缺血变深呈紫黑色，迅速切除上下极及左肾外侧缘，共切除约2/3肾组织，用明胶海绵止血后还纳体内，向腹腔内注入青霉素后，缝合，消毒。7-10 d后行第2次手术。同切除左肾的方法，行右侧斜向外下方(肾区)切口3-4 cm，充分暴露右侧肾脏，分离肾包膜，结扎肾蒂，待肾脏缺血变深色时，切除右肾，缝合、消毒。

两次手术共切除约5/6肾脏。待大鼠苏醒后，放入单笼饲养，保持呼吸道通畅，术后禁食24 h，不禁水，术后密切观察皮肤切口、精神状态和进食进水情况。假手术组不切除肾组织，只给予先后2次麻醉和分离双肾脂肪囊。

右肾切除术后1周，选取存活的18只大鼠，随机分为假手术组、模型组和促红细胞生成素组(皮下注射促红细胞生成素40 IU/kg)，每周2次，直至处死。

1.4血清学指标检测

酶法测定血清肌酐(Scr)浓度，用血细胞分析仪测定Hb的值。

1.5残余肾组织病理学检查

肾组织常规固定，脱水，透明，包埋后3 μm切片，行HE染色和Masson观察其不同时间点肾组织的病理变化，并进行半定量评分，其评分标准同文献[6]。

1.6免疫荧光法观察HIF-1在肾组织的表达

采用BX51/BX52系统软件分析FITC标记的HIF-1免疫荧光，阳性细胞呈绿色荧光，定位显示绿色荧光。采用图像半定量分析方法，每张切片在肾皮质部位随机采集20个不重叠视野，光镜下计数HIF-1阳性细胞核，以核数/HP表示。

1.7 Western blot印迹检查HIF-1蛋白质的表达

用蛋白质抽提试剂提取蛋白质，在12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，并且电泳的产物转到硝酸纤维膜上。用含有5%的脱脂奶粉封闭膜1 h，加入一抗(以1∶100稀释)于4 ℃孵育过夜，用TBST和TBS洗完膜后，HRP标记的二抗(以1∶500稀释)在室温下孵育1 h，然后再次用TBST和TBS洗膜，用ECL显色并曝光成像。以beta-actin为内参，应用紫外透视成像系统对X线片进行光密度分析蛋白质的相对表达量，并扫描。

1.8统计学分析

2　结果

2.1大鼠肾功能及血红蛋白改变

与假手术组比较，模型组血肌酐明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)，模型组与EPO干预组相比，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。与假手术组比较，模型组Hb明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)，EPO干预组贫血较模型组有所改善，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2残余肾组织病理改变

HE和Masson染色发现，假手术组肾小球、肾小管、肾间质无明显改变(图1A、D)。模型组部分肾小球结构紊乱，出现节段性硬化，肾间质局灶性纤维化，炎性细胞浸润，上皮萎缩(图1B、E)。注射EPO后，残余肾组织的病理改变不明显(图1C、F)。模型组肾小球硬化指数为3.24±0.98，EPO组为3.13±0.88，两组之间差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表1各实验组大鼠测血清肌酐、Hb含量比较(n=6)

Table 1Comparison of serum Scr and Hb contents among three groups(n=6)

组别 Scr(μmol/L)Hb(g/L)假手术组25.78±0.8115.21±0.52模型组125.79±14.09*11.30±0.52*EPO组126.24±13.99*12.55±0.53#

与假手术组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05

图1　残余肾组织的形态学改变 (×40)Figure 1　Changes of renal pathology by HE and Masson staining (×40)

表2各组实验大鼠肾小球硬化指数和肾小管间质损伤程度比较(n=6)

Table 2Comparison of glomerulosclerosis index and damage degree of renal tubule among three groups(n=6)

组别肾小球硬化指数肾小管损伤程度假手术组0.00±0.000.01±0.01模型组3.24±1.39*4.76±0.50*EPO组3.13±1.23*4.90±0.49*

与假手术组比较，*P<0.05

2.3免疫荧光检查HIF-1在残肾组织中的表达

在免疫荧光中，HIF-1阳性细胞呈绿色荧光，定位显示为黄色荧光。假手术组HIF-1在肾组织细胞核染色偶见(图2A)，相反HIF-1在残余肾组织术后3个月，细胞核黄染阳性率增加明显，主要在萎缩扩张的肾小管上皮细胞表达明显(图2B)。但是注射EPO之后，HIF-1表达相应地减少(图2C)。同时检测HIF-1在免疫荧光中的核阳性(细胞核/HP)计数，所得结果如下：与假手术组比较(HIF-1核阳性3±0.56)，模型组HIF-1核阳性达28±1.32，且HIF-1主要在萎缩扩张的肾小管上皮细胞表达。注射EPO后，HIF-1的表达减少，HIF-1核阳性数为20±1.48(P<0.05，见图3，表3)。

A.假手术组　　　　　　　　　　　B. 模型组　　　　　　　　　　　C. EPO组图2　 HIF-1在残肾组织中表达免疫荧光 (×40)Figure 2　HIF-1 expression in remnant kidney by immunofluorescence (×40)

2.4Western blot免疫印迹检查HIF-1在残肾组织中的表达

通过Western blot检测发现，以actin为内参，随着机体缺氧增加HIF-1蛋白表达有所变化。模型组和EPO组的残余肾组织的HIF-1蛋白显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05，见图3,表3)。Western Blot结果显示：术后随着机体缺氧逐渐加重，HIF-1的蛋白水平表达逐渐增加 。

1.假手术组；2.模型组；3.EPO组图3　大鼠残肾组织 HIF-1蛋白的Western blotFigure 3　Expression of HIF-1 protein in residual kidney tissues by Western blot

表3残肾组织中HIF-1的表达比较(n=6)

Table 3The HIF-1 expression in residual renal tissues(n=6)

组别HIF-1阳性表达数HIF-1灰度值假手术组3±0.561.7528±0.7412模型组28±1.32*5.8017±0.5904*EPO组20±1.48*#4.9017±0.5984*#

与假手术组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05

3　讨论

肾性贫血是慢性肾衰竭患者常见的并发症之一，促红细胞生成素分泌的相对或绝对不足以及红细胞寿命的缩短是慢性肾衰竭肾性贫血的主要原因，研究显示，红细胞寿命的缩短与EPO抵抗有关[7]，自1989年rhEPO应用于临床，有效地减少和改善肾性贫血的发生率，然而也有部分患者应用EPO以后，血红蛋白水平达不到目标值，可能存在EPO抵抗，因此从分子水平治疗肾性贫血显得尤为重要，所以本研究利用建立大鼠慢性肾衰竭模型，进一步研究影响慢性肾衰竭患者预后的因素。

我们采用大鼠5/6肾切除术后90 d模型，手术组大鼠的Scr值明显升高，Hb下降。在肾脏病理观察中，大鼠肾脏在术后90 d时出现肾小球病变加重，肾小球局灶性硬化，上皮萎缩，肾小管间质纤维化等慢性化指标，这与许多文献报道一致[5,6]，说明慢性肾衰竭动物模型制备成功。

众所周知，慢性缺血缺氧是促进慢性肾脏病进展和纤维化的重要因素[8,9]。缺氧是肾纤维化发生的重要机制[10]，缺氧诱导缺氧诱导因子(HIF)的表达，从而能减轻肾纤维化的发生，其中HIF-1起主要介导作用[11]。慢性肾功能衰竭时，机体出现贫血状态，从而会导致机体组织缺血缺氧，继而会诱发HIF-1的表达显著增加。本研究所建立的残余肾组织模型中，经免疫荧光染色观察发现，HIF-1核阳性主要位于萎缩扩张的肾小管上皮细胞，这与Kairaitis等[12]在小鼠阿霉素肾病中描述的一致，其次在肾小球也有表达。另外，通过Western blot检测HIF-1蛋白表达水平方面，HIF-1 在模型组表达明显增加，但是注射EPO之后，检测残余肾组织HIF-1表达的变化发现，HIF-1表达减少，说明HIF-1在改善贫血方面起重要作用，其可能机制是HIF-1是一种转录调节因子[13]，其能与人促红细胞生成素(EPO)基因3′端增强的核苷酸序列特异性结合，促进EPO生成，因此，在肾性贫血中，HIF-1的表达增加能改善其肾性贫血状态。

综上所述， HIF-1可能在纠正CKD患者贫血中起重要的作用，将来运用诱导HIF-1基因表达或直接给予HIF-1蛋白在治疗CKD患者贫血状态中具有广阔的前景，对提高患者的生存质量和改善预后具有极其重要意义。

[1]Suzuki N.Erythropoietin gene expression:developmental-stage specificity,cell-type specificity and hypoxia inducibility[J].Tohoku J Exp Med, 2015,235(5):233-240.

[2]Garrido P,Ribeiro S,Fernandes J,etal.Iron-hepcidin dysmetabolism, anemia and renal hypoxia,inflammation and fibrosis in the remnant kidney rat model[J].PLoS One,2015,10(4):124-148.[3]Nangau M.Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury:a final common pathway to end-stage renal failure[J].Am Soc Nephro,2006,17:17-25.

[4]沙朝晖,付平,周莉,等.大鼠5/6肾切除慢性肾功能衰竭动物模型的实验研究[J].四川动物,2006,25(3):632-634.

[5]Barata K,Yoshida M,Hokao R,etal.Function in 5/6 nephrectomized rats basic study for renal toxicity using 5/6 nephrectomized rats[J].J Toxicol Sci,1998,23(5):433-442.

[6]马宏,陈香美,王建中,等.7/8肾切除大鼠凝血纤溶系统的变化[J].中华肾脏病杂志,2001,17(4):250-254.

[7]吴恩亮,高芳,刘玉芳,等.虫草制剂联用促红细胞生成素治疗血透患者肾性贫血的临床研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2010,11(4):351-352.

[8]Fine LG,Norman JT.Chronic hypoxia as a mechanism of progression of chronic kidney disease:from hypothesis to novel therapeutics[J].Kidney Int,2008,74(7):867-872.

[9]Eckardt KV,Bernhard WM,Weidemann A,etal.Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease[J].Kidney Int Suppt,2005,99:S46-S51.

[10]侯凡凡.肾脏慢性纤维化的最新研究对临床防治的启迪[J].解放军医学杂志,2008,33(1):6-7.

[11]Rankin EB,Giaccia AJ.The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis[J].Cell Death Differ,2008,15(4):678-685.

[12]Kairaitis LK,Wang Y,Gassmarn M,etal.HIF-1a expression follows microvascular loss in advanced murine adriamycin nephrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2005,288(1):F198-F206.

[13]Huang LE,Buan HE.Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance[J].J Biol Chem,2003,278(22):19575-19578.

Effect of HIF-1 on anemia of the chronic renal failure rats induced by 5/6 nephrectomy kidney

SUN Xiuli*,FENG Guozheng,HOU Guocun,LEI Zhenkun,SHANG Xiaomei

(DepartmentofNephrology,BaotouCentralHospital,Baotou014040,China;*Correspondingauthor,E-mail:btszbdf@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of HIF-1 expression in the remnant kidney on anemia in the chronic kidney failure model rats caused by 5/6 nephrectomy.MethodsSD male rats with 5/6 nephrectomy were randomly divided into three groups: sham group, model group and EPO group. In EPO group, the recombinant human erythropoietin(rhEPO) 40 IU/kg was injected subcutaneously twice a week at 3 week after operation till the rats were killed. The experimental animals were sacrificed at 90 d after surgery. The samples of blood and residual kidney tissue were collected to detect the contents of Scr and Hb and observe the pathological changes by HE and Masson staining, respectively. Protein expression level of HIF-1 was detected by Western blot and immunofluorescence assay.Results①In model group, most glomeruloes in the remnant kidney showed segmental glomerulosclerosis, renal interstitial fibrosis and gland atrophy. Compared with sham group, the glomerulosclerosis index was significantly increased in model group(P<0.05). However, there was no significant difference between model group and EPO group.②Compared with sham group, the Scr content increased obviously in model group and EPO group(P<0.05). However, there was no significant difference between model group and EPO group(P>0.05).③Compared with sham group, the Hb content increased significantly in model group(P<0.05). But there was no significant difference between model group and EPO group(P<0.05).④Compared with sham group, the expression of HIF-1

chronic renal failure;anemia；HIF-1;hemoglobin

包头市社会发展科技支撑资助项目(2013S2006-04-05)

孙秀丽，女，1963-10生，硕士，主任医师，E-mail：332876922@qq.com

2015-12-02

R692

A

1007-6611(2016)03-0223-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.007