Id-1在结直肠癌中的表达及其临床意义

武雪亮, 王立坤, 薛　军*, 杨东东, 屈　明, 郭　飞, 杨瑞敏, 刘　博

(1河北北方学院附属第一医院血管腺体外科，张家口 075000； 2河北北方学院附属第一医院超声医学科； 3河北北方学院附属第一医院病理科；*通讯作者，E-mail：yfyxuejun@163.com)



Id-1在结直肠癌中的表达及其临床意义

武雪亮1, 王立坤2, 薛军1*, 杨东东1, 屈明1, 郭飞1, 杨瑞敏2, 刘博3

(1河北北方学院附属第一医院血管腺体外科，张家口 075000；2河北北方学院附属第一医院超声医学科；3河北北方学院附属第一医院病理科；*通讯作者，E-mail：yfyxuejun@163.com)

目的研究DNA结合分化抑制蛋白1(Id-1)在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理参数间的相关性。方法选取我院结直肠癌和正常黏膜组织各50例，应用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测两组中Id-1 mRNA和蛋白质的表达情况，并应用免疫组化法(SP)检测Id-1在两组中的表达，分析Id-1在结直肠肿瘤发生、发展中的作用。结果结直肠癌组织中Id-1 mRNA的表达水平较正常组织高(0.96±0.03vs0.20±0.04，P=0.011)；Id-1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较正常组织高(0.82±0.04vs0.31±0.02，P=0.020)。免疫组化显示Id-1在结直肠癌组织组中阳性表达明显高于正常黏膜中的表达，差异有统计学意义(72.00%vs24.00%，χ2=23.431，P=0.000)。Id-1表达与肿瘤浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润等密切相关(均P<0.01)，而与肿瘤大小及分化程度无关(P>0.05)。结论Id-1的特异性高表达与结直肠腺癌的发生、发展具有较高的相关性，有望成为特异性较高的肿瘤标志物。

DNA结合分化抑制蛋白1；结直肠肿瘤；逆转录聚合酶链反应；Western blot；免疫组化

DNA结合分化抑制蛋白1(inhibitors of DNA binding-1,Id-1)是近年来研究较热的一种致癌基因, 动物实验表明其可促进细胞增殖，诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤生长侵袭，加速肿瘤生长并转移[1,2]。目前已证实Id-1在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等多种恶性肿瘤中呈高表达状态[3-5]，但在结直肠方面研究较少。本研究通过对Id-1行免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blot分析检测，旨在探讨Id-1在结直肠癌中的表达情况及其与相关临床病理因素间的关系。

1　材料与方法

1.1病例资料

收集2012-05～2014-05河北北方学院附属第一医院血管腺体外科手术切除的结直肠癌组织50例和正常组织50例，癌组织取自癌灶中心处，另取标本残端切缘经病理证实为正常肠组织。全部病例均为原发性肿瘤，且术前未行新辅助放化疗等针对性治疗。其中男 ∶女为29 ∶21,年龄33-71岁，平均(51.2±2.9)岁;正常结直肠组织中,男 ∶女为28 ∶22,年龄33-69岁，平均(52.0±2.1)岁。两组一般资料具有可比性(P>0.05)。1.2主要试剂与实验方法

1.2.1主要试剂兔抗人单克隆浓缩型Id-1抗体(ab50932 R2-1G6)，购于香港abcam公司；兔抗人GAPDH多克隆一抗(ab54621 R2-3)、羊抗兔二抗(ab5214 R2-2)，购于美国Santa Cruz公司；总RNA提取试剂、反转录试剂盒、SDS-PAGE标准指示剂、BCA蛋白定量试剂盒均购自Fementas公司；RIPA试剂购自Solarbio公司；DAB显色剂购于TIANGEN公司。引物由TaKara生物工程公司合成。

1.2.2RT-PCR法检测Id-1 mRNA表达提取并测定总RNA浓度，设计Id-1上游引物：5′-CTGAGGCACTGGCGAGGAGA-3′，下游引物：5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′，扩增长度140 bp；GAPDH(内参)上游引物：5′-ACCCACTCCTCCACCTTGA-3′，下游引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′，扩增长度：107 bp。反应体系：1×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，cDNA模板2 μl，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μl，RNA酶抑制剂1 μl，反应总体积25 μl。根据试剂盒说明书操作进行扩增：以1 μlDNA样本作为模板，以去离子水为阴性对照模板；扩增条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃10 s，退火温度15 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。产物于2%琼脂糖凝胶后电泳分离，于紫外线灯下观察结果。

1.2.3Western blot法检测Id-1蛋白表达RIPA裂解液提取总蛋白并定量。取50 μg蛋白，置入5×缓冲液(4∶1)，100 ℃水浴，5 min 3次，8%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，后转至PVDF膜，取出膜，加5%脱脂奶粉封闭，弃封闭液滴加特异性的一抗(Id-1：1∶1 500；GAPDH：1∶150)4 ℃孵育过夜，加TBST洗涤液，10 min 3次，滴加特异性二抗(1∶1 500)37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗涤液，10 min 3次，ECL法检测条带，进行密度定量分析。

1.2.4免疫组织化学染色检测Id-1蛋白表达10%甲醛溶液固定部分标本，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，使用苏木精-伊红(hematoxylin-esin，HE)染色方法，病理诊断。切片经80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液高温高压水化修复；PBS洗3次，加一抗，4 ℃过夜；PBS洗3次，加二抗。室温下DAB显色，苏木精轻度复染，并用1%的盐酸乙醇分化5 min、流水冲5 min、梯度乙醇脱水、松节油透明5 min，最后树胶封片，阴性对照为PBS代替一抗。

Id-1阳性表达的判定：细胞质中染有棕黄色，褐色颗粒为阳性细胞，计算阳性细胞百分比并评分，≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分；无着色:0分，浅黄色:1分，黄色:2分，深黄色:3分。两者相乘，0分为(-),1-4分为(+),5-8分为(++),9-12分为(+++),(+)-(+++)均视为阳性。

2　结果

2.1Id-1的RT-PCR检测结果

以Id-1/GAPDH比值作为RT-PCR定量分析，癌组织中Id-1 mRNA 的表达水平明显高于结直肠正常组织，差异具有统计学意义(0.96±0.03vs0.20±0.04，P=0.011,见图1)。

1，3.结直肠癌组； 2，4.结直肠正常组图1　RT-PCR检测结直肠癌及正常肠黏膜组织Id-1 mRNA的表达Figure 1　Expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by reverse-transcription polymerase chain reaction

2 2Id-1的Western blot检测结果

以Id-1/GAPDH比值做蛋白定量检测，Id-1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较结直肠正常组织高，差异具有统计学意义(0.82±0.04vs0.31±0.02，P=0.020,见图2)。

1，3. 结直肠癌组； 2，4.结直肠正常组　　图2　Western blot印迹法检测结直肠癌及正常黏膜组织Id-1蛋白的表达Figure 2　Expression level of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by Western blot

2.3Id-1的免疫组化检测结果

Id-1在结直肠癌组织组阳性表达率是72.00%(36/50)，明显高于正常黏膜的24.00%(12/50)，差异具有统计学意义(χ2=23.431，P=0.000，见图3及表1)。

2.4Id-1蛋白与临床病理参数之间的关系

Id-1蛋白的表达水平与患者肿瘤大小、分化程度无关，而与肿瘤浆膜浸润、肝转移、淋巴结转移、肿瘤TNM分期、脉管浸润密切相关(P<0.01，见表2)。

A.结直肠正常组织　　　　　　　　　　　　B.结直肠癌组织　图3　免疫组化检测结直肠组织中Id-1蛋白的表达 (SP,×200)Figure 3　Expression level of Id-1 protein in colorectal tissues detected by immunohistochemistry (SP，×200)

表1Id-1蛋白在结直肠癌组织及正常组织中的表达(例)

Table 1Positive expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues(cases)

组别nId-1-++++++χ2P正常组503874123.4310.000癌组501461119

3　讨论

Id-1系螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)转录因子家族重要成员，是细胞分化的负性调控因子，其广泛表达于哺乳动物的胚胎、生殖腺体及一些分化不成熟的组织细胞中，在正常组织中呈微量表达或不表达状态，而在诸多恶性肿瘤及体外培养的肿瘤细胞系中高表达，且与肿瘤的恶性潜能及预后相关[6]。大多数HLH结构存在一个碱性HLH(bHLH)因子与其紧密相邻，二者相互结合形成异质二聚体与目标DNA结合，诱导启动子中的E-盒样结构的靶基因转录并整合成所谓的“E-box”DNA序列，从而调控细胞增殖分化[7]。

Id-1通过多种途径促进细胞增殖及侵袭。研究

证实，Id-1通过与E2A结合形成特异性复合物抑制E2A活化P21，激活CDK2诱导Rb蛋白磷酸化，抑制细胞分裂周期中G1/S停滞，促使细胞分裂周期顺利进行[8]。Id-1表达上调能促进TGF-β1的表达，进而下调E-钙黏蛋白表达，诱导上皮细胞间质化，导致细胞间极性消失、黏附力下降，使肿瘤细胞突破基底膜屏障，向邻近组织迁移、浸润[9,10]。

本实验结果显示Id-1mRNA和蛋白在腺癌组织中的表达明显高于正常组织，证实Id-1特异性高表达可能在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用。Pillai等[11]研究表明Id-l在非小细胞肺癌组织中的表达随肿瘤浸润深度的加深而逐步增高，随着淋巴结和远处转移而增强，在TNM Ⅲ和Ⅳ期的肺癌组织中表达较高。李晓梅等[12]对60例食管鳞癌组织行免疫组化检测显示Id-1在食管鳞癌组织中的阳性表达明显高于正常食管黏膜。朱博等[13]研究证实，Id-1在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜和胃癌组织中的阳性表达呈逐步上升趋势，且差异明显，且与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和预后明显相关，Id-1阳性患者生存期明显低于阴性者。深入研究发现：结直肠癌伴浆膜浸润者较未侵及浆膜者Id-1蛋白表达明显增高；伴肝转移、淋巴结转移、血管浸润者较无转移浸润者Id-1蛋白表达明显增高；TNM分期越高，Id-1蛋白表达也越高，表明Id-1蛋白表达水平与结直肠肿瘤的恶性生物学行为密切相关，对结直肠癌的侵袭、转移有促进作用。郭云等[14]对62例直肠癌组织性免疫组化检测发现Id-1在癌组织中呈100%阳性染色，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关，且与Ki-67和VEGF亦呈正相关性，考虑Id-1与Ki-67和VEGF具有协同作用；胡斌等[15]研究显示结直肠癌中Id-1能上调MT1-MMP的表达水平，使MMP-2、MMP-9等基因金属酶类过表达，促进基底膜的降解，加速癌细胞的浸润转移；此外，研究证实[10]，Id-1还能通过促进VEGF表达、抑制TSP-1表达两方面共同作用，诱导肿瘤新生血管的形成，为肿瘤的生长、浸润和转移提供营养基础。

表2Id-1在结直肠癌组织中的表达及与相关临床病理指标的关系

Table 2Expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its correlation with clinical pathological features

病理参数nId-1-+阳性率(%)χ2P肿瘤大小0.0430.836 ≥5cm3192270.97 <5cm1951473.68分化程度0.0740.964 高123975.00 中2161571.43 低1751270.59浆膜浸润4.5210.034 有3993076.92 无115654.55TNM分期7.0440.008 Ⅰ+Ⅱ136753.84 Ⅲ+Ⅳ3782978.38淋巴结转移15.2530.000 有2922793.10 无2112942.86肝转移8.3330.003 有15015100.00 无351421 60.001脉管浸润4.0790.043 有16215 93.75 无341221 61.76

综上所述，Id-1的高表达与结直肠癌的发生、发展及其恶性生物学行为具有高度的相关性，因而Id-1有望成为新的肿瘤监测指标，为临床诊治及预后监测提供重要的参考。本实验仅对Id-1在结直肠癌中的表达及与临床病理特征的关系做出了相关研究，但对其致癌机制、作用通路未有相应研究，对Id-1抑制剂的应用是否可抑制细胞增殖的研究尚未有相关实验加以证实，这也将是本课题进一步的研究方向。

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Expressions of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its clinical significance

WU Xueliang1, WANG Likun2, XUE Jun1*, YANG Dongdong1, QU Ming1, GUO Fei1, YANG Ruimin2, LIU Bo3

(1DepartmentofVascularGland,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;2DepartmentofUltrasound,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;3DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：yfyxuejun@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Id-1 in human colorectal adenocarcinoma tissues and explore their correlation with clinical pathological parameters of colorectal cancer.MethodsThe expression levels of Id-1 mRNA and protein in 50 specimens of normal colorectal tissues, and 50 specimens of colorectal adenocarcinoma tissues were detected using reverse-transcription polymerase chain reaction and Western blot. Meanwhile Id-1 protein was detected using immunohistochemistry. The correlation between Id-1 expression and the clinical pathological features was analyzed.ResultsThe expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues and normal colorectal tissues were 0.96±0.03 and 0.20±0.04, and there was significant difference(P=0.011).The expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues(0.82±0.04vs0.31±0.02,P=0.020).The positive expression rate of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues (72.00%vs24.00%,χ2=23.431,P=0.000).Expression of Id-1 was correlated with the depth of tumor invasion,TNM stage,lymph node metastasis,vessel invasion,and liver metastasis(P<0.01),but not with the tumor size and differentiation degrees(P>0.05).ConclusionThe high expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues plays an important role in the process of cancer, and is expected to become a new tumor monitoring indicator for clinical diagnosis and treatment and prognosis judgment.Key words:Id-1;colorectal neoplasms;RT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

河北省卫计委医学科学研究重点课题计划资助项目(20150058); 河北省科技支撑计划资助项目( 152777237); 河北省张家口市科技局指令性计划资助项目(1311055D)

武雪亮，男，1984-09生，硕士，主治医师，E-mail：wxlwlk@163.com

2015-11-12

R735.37

A

1007-6611(2016)03-0228-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.008