猪圆环病毒2型诱导小鼠Peyer's结淋巴细胞凋亡规律研究

毛　玉，李进军，王乃东，刘　沅，邓治邦

(湖南农业大学动物医学院，湖南 410128)



猪圆环病毒2型诱导小鼠Peyer's结淋巴细胞凋亡规律研究

毛玉△，李进军△，王乃东，刘沅，邓治邦*

(湖南农业大学动物医学院，湖南 410128)

为了用小鼠做模型探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)诱导Peyer's结淋巴细胞凋亡的规律，本试验用PCV-2感染5周龄昆明系小鼠，分别在感染后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天处死小鼠，取脾脏、腹股沟淋巴结、Peyer's结通过PCR鉴定PCV-2感染情况，同时从Peyer's结分离淋巴细胞， 利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测Peyer's结淋巴细胞的凋亡。结果显示，攻毒小鼠在感染后第7天、第14天、第 21天、第28天和第35天 5组中凋亡的细胞百分比分别是0.69%±0.13%、1.72%±1.00%、3.25%±0.59%、4.72%±0.30%和9.06%±0.96%。随着感染时间的延长，PCV-2感染小鼠的Peyer's结淋巴细胞凋亡数量逐渐增加。

猪圆环病毒2型；Peyer's结；细胞凋亡；流式细胞术

猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovius associated diseases,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)引起的威胁世界养猪业的重要免疫抑制性疾病[1-2]。PCVAD包括怀孕母猪流产(Productive failure)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis nephritis syndrome,PDNS)和PCV-2相关性肠炎(PCV-2-assciated enteritis)等[3]。PCV-2可以诱导小肠Peyer's结淋巴细胞的凋亡[4]。当猪小肠Peyer's结内发生淋巴细胞凋亡时，会引起猪肠道免疫抑制，损害猪肠道的正常机能，导致猪发生病毒性肠炎，表现为腹泻，抗生素治疗无效。现有大量研究证明小鼠可以作为PCV-2感染模型[5-7]。本试验建立小鼠PCV-2感染病理模型，分别在PCV-2感染小鼠后第7天、第14天、第21天、第28天和第35天检测Peyer's结淋巴细胞的凋亡，通过研究PCV-2诱导小鼠Peyer's结淋巴细胞的凋亡规律，为阐明PCV-2诱导猪的Peyer's结淋巴细胞凋亡规律奠定基础，并为探讨PCV-2导致猪腹泻的致病机制提供基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒PCV-2b感染性克隆(GenBank 登录号：KJ867555)由湖南农业大学功能蛋白组学实验室提供。

1.1.2实验动物体重18 g～22 g的5周龄昆明系雌性小鼠35只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2009-0009]。

1.1.3主要仪器设备Applied Biosystems 2720 PCR仪，美国应用生物系统中国公司产品；ChampGel 6000 全自动凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司产品。DYY-7C型电泳仪，为北京六一仪器厂产品；Eppendorf 5427R型台式高速离心机，Eppendorf公司产品；Motic AE20/21 倒置显微镜，北京信诺莱伯仪器公司；Canto2流式细胞仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2方法

1.2.1实验动物分组将小鼠随机分成2组，即试验组(test，n=21)和对照组(Control,n=14),试验组经腹腔注射1 000 TCID500.3 mL的PCV2病毒液。对照组经腹腔接种同体积不含病毒的培养液0.3 mL。接种后的感染鼠与对照鼠分别置于恒温(温度26℃)的不同房间饲养，提供小鼠专用饲料和灭菌饮水，由专人饲养管理。

1.2.2样品采集与处理小鼠感染后第7天、第14天、第21天、第28天和第35天， 试验组随机各取3只、对照组随机各取2只，处死，腹部脱毛、消毒后在腹部正中切口，无菌取脾脏、腹股沟淋巴结及Peyer's结备用。

1.2.3PCV-2感染试验

1.2.3.1引物的设计与合成根据参考毒株PCV-2全长序列(GenBank登录号：AY321991)，利用Primer5.0软件设计引物，引物序列为F primer5′-CCATATGAAATAAATTACTGAG-3′;R primer5′-CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG-3′。 扩增的目的基因为785 bp。扩增产物用Blast软件验证序列的正确性。

1.2.3.2病毒DNA提取病毒DNA的提取方法参照天净沙系列柱式动物DNAout试剂盒操作说明。

1.2.3.3PCR反应体系及条件PCR体系为25 μL，其中包括12.5 μL的2×Taqmaster mix(购自北京全式金生物技术有限公司)，上、下游引物0.5 μL，模板各2 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为:94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 48 s，30个循环；72℃ 7 min。

1.2.3.4PCR产物的检测取PCR产物5 μL ，采用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统下拍照分析。

1.2.4Peyer's结淋巴细胞的分离及细胞悬液制备将无菌培养皿中的Peyer's结置于RPMI1640培养液中暂时冷藏储存，待全部Peyer's结收集于不同的EP管中后，集中处理制备单细胞悬液。用镊子夹出Peyer's结，置于装有200目尼龙网(尼龙网保持悬空)的漏斗上，加1 mL 0.01 mol/L PBS，漏斗下部接有35 mm平皿，使用玻璃注射内芯倾斜30度轻轻研磨，单细胞能够顺缓冲液流过尼龙纱布，收集于下方的平皿中。

将细胞悬液吹打分散后台盼蓝染色检测细胞活力并计数，活细胞数高于90%以上时调整细胞浓度为106个/mL备用。细胞悬液体积调整为1.0 mL。

1.2.5淋巴细胞凋亡的检测根据Annexin V FITC/PI试剂盒说明，将制备好的细胞悬液用冷PBS洗涤2次后，用100 μL 1×Binding buffer悬浮细胞，在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining solution，轻轻混匀。避光反应10 min。加入400 μL 1×Binding buffer混匀，样品在1小时内用流式细胞仪(BD canto2 ,USA)检测淋巴细胞凋亡。Annexin V FITC/PI双标记流式细胞术以FITC和PI荧光作双参点图，检测细胞分为4个区，Q1区：机械损伤细胞(Annexin V FITC-/PI+)；Q2区：凋亡晚期或坏死细胞(Annexin V FITC+/PI+)；Q3区：早期凋亡细胞(Annexin V FITC+/PI-)；Q4区：活细胞(Annexin V FITC-/PI-)。计数4群淋巴细胞比例并分别在PCV-2感染后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天进行比较。计数感染后第14天对照组及试验组的细胞比例。

2　结果

2.1小鼠脏器中PCV-2核酸载量检测

病毒感染后第14天、第21天、第28天、第35天在脾脏、腹股沟淋巴结和Peyer's结中可以检测到PCV-2核酸，而对照组未检测到病毒(图1和表1)，说明小鼠已经成功感染PCV-2。

M.DNA标准DL 2 000；1～2.对照组小鼠Peyer's检测结果；3～5.试验组小鼠Peyer's检测结结果；6.阴性对照；7.阳性对照

M:DNA marker DL 2 000；1-2:Peyer's patches of control mouse；3-5.Peyer'spatches of test mouse；6.Negative control；7.Positive control

图1感染后第14天小鼠Peyer's结PCV-2 核酸检测

Fig.1The detection results of PCV-2 DNA in Peyer's patches of mice at 14 days post infection

2.2小鼠Peyer's结淋巴细胞凋亡检测结果

从FITC和PI荧光双参散点图(图2)可以看到，对照组淋巴细胞主要分布在Q4区，因操作等原因引起的机械性死亡细胞死亡数量非常少(<0.2%)。随着感染时间的延长，凋亡细胞数量随之增加(表2)。

3　讨论

PCV-2是一种单股共价闭合环状DNA病毒，对免疫系统的影响较大，该病毒优先感染淋巴组织，引起与体液免疫相关的T、B淋巴细胞比例下降，从而影响机体对病原体的免疫应答能力,导致机体产生免疫抑制[8]。PCVAD最早发现于加拿大，此后很快蔓延至美国、西班牙、英国、丹麦、德国、荷兰、比利时等国家。我国学者于2000年首次证实国内猪场存在PCV-2感染。现今PCV-2感染在中国非常普遍[9-10]。PWMS是最早报道的也是最多见的PCV-2相关疾病，PCV-2多分布于患病仔猪的淋巴结，脾脏等淋巴组织中[11]。患病仔猪可产生严重的免疫抑制，造成体内淋巴细胞的耗竭，严重影响仔猪健康。该病毒具体的致病机制还不十分清楚，对单核巨噬细胞的亲嗜性和引起淋巴细胞大量凋亡是导致宿主免疫力低下的重要原因[12]。施旅娟等[13]对PCV-2感染后的仔猪淋巴结的细胞凋亡进行了定位和定量检测,发现PCV-2作用后可引起淋巴结淋巴细胞的凋亡,且凋亡主要发生在淋巴小结的生发中心。PCV-2通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖导致淋巴小结中淋巴细胞严重缺失。肠炎也是PCVAD的症状之一[14-15]，小肠黏膜不仅是消化、吸收营养物质的场所，也是肠道黏膜免疫系统是机体抵御肠道病原体感染的第一道防线，构成机体防御肠道病原微生物入侵的第一道屏障，担负着重要的免疫功能[16-18]。Peyer's结是肠黏膜免疫系统的重要组成部分[19]，是小肠黏膜内的一组淋巴滤泡，滤泡内由B细胞和T细胞组成，分布于肠黏膜固有层和上皮内并与细胞分泌的细胞因子共同组成肠黏膜免疫体系。由PCV-2感染引起的仔猪肠炎的病理组织学特征为大肠和小肠出现肉芽肿性炎症(上皮样细胞和多核巨细胞浸润),Peyer's结淋巴缺失,同时可导致肠绒毛变短[20]。该症状可发生于仔猪生长发育的任何阶段，尤以新生仔猪最为严重，临床表现为腹泻、仔猪生长发育缓慢或体重减轻，抗生素治疗无效，混合感染会导致腹泻症状加重、病程延长[21]。本文探讨PCV-2诱导小鼠Peyer's结淋巴细胞凋亡的规律，利用小鼠复制该病理模型，为仔猪腹泻的致病机制奠定基础。研究结果发现，随着感染时间的增长，凋亡细胞逐渐增加。PCV-2感染小鼠后第7天可以观察到Annexin V单阳性细胞，即细胞开始出现凋亡，随着感染天数的增加，凋亡细胞逐渐增多。表明小鼠小肠免疫水平会随着PCV-2感染时间的延长而降低。

表1　小鼠脏器中PCV-2核酸检测结果

注：*阳性样品/检测样品。

Note.*positive samples/tested samples.

1～2.对照组Peyer's结淋巴细胞FITC与PI染色十字门图；3～5.试验组Peyer's结淋巴细胞FITC与PI染色十字门图

1-2.Dye FITC and PI cross gate figure of lymphocytes in Peyer's patches of control group；3-5.Dye FITC and PI cross gate figure of lymphocytes in Peyer's patches of test group.

图2　PCV-2感染后第14天Peyer's结淋巴细胞的凋亡FITC与PI染色十字门图

利用流式细胞仪检测新鲜提取的细胞凋亡需要短时间内提供活率较高的细胞，本试验用玻璃注射器内芯倾斜30度，在200目尼龙网上(尼龙网保持悬空)研磨Peyer's结，淋巴细胞沿着尼龙网流入35 mm的培养皿。尼龙网保持悬空避免了玻璃注射器内芯在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡。尼龙网向上的反弹力可以控制研磨力度，避免出现研磨力度过大而细胞死亡的现象。200目尼龙网过滤避免细胞碎片过多，影响检测结果。玻璃注射器内芯倾斜30度研磨使Peyer's结研磨充分并且注射器的光滑面可以减少其对细胞的损伤。这种方法方便快捷，并且提取的淋巴细胞活率较高，可以作为提取Peyer's结淋巴细胞的首选方法。

本研究利用小鼠做病理模型，检测PCV-2感染后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天的小鼠Peyer's结淋巴细胞凋亡，发现了PCV-2感染后Peyer's结淋巴细胞凋亡的数量随着PCV-2感染时间的延长而降低。 此发现为PCV-2诱导猪的Peyer's结淋巴细胞凋亡规律奠定了基础，并为探讨PCV-2导致猪腹泻的致病机制提供了基础资料。

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Study on PCV-2-induced Lymphocytic Apoptosis Rule in Peyer's Patches of Mice

MAO Yu,LI Jin-jun,WANG Nai-dong,LIU Yuan,DENG Zhi-bang

(College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China)

In order to discuss the lymphocytic apoptosis rule with mouse model,the 5-weeks old KM mice were inoculated intraperitoneally with PCV-2 in this experiment and sacrificed at 7,14,21,28,35 days post infection.The samples of spleen,inguinal lmph nodes and Peyer's patches were collected from all mice,and the infection condition of PCV-2 was identified with PCR.At the same time,lymphocytes were collected from Peyer's patches for detection of apoptosis by flow cytometry with annexin V FITC/PI double staining.Results showed,the lymphocytic cell percentage of apoptosis was 0.69%±0.13% at 7 day post infection,1.72%±1.00% at 14 day post infection,3.25%±0.59% at 21 day post infection,4.72%±0.30% at 28 day post infection and 9.06%±0.96% at 35 day post infection.The apoptosis percentage of lymphocytes was increased with the growth of infection time.

Porcine circovirus 2;Peyer's patch;apoptosis；flow cytometry

2016-03-01

国家自然科学基金项目(31372406);湖南省自然科学基金项(2015JJ2082);湖南省教育厅重点项目(15A086)作者简介：毛玉(1990-)，女，甘肃酒泉人，硕士研究生,主要从事动物病理学研究。△同等贡献作者 *通讯作者

S852.659.2;S852.3

A

1007-5038(2016)08-0045-05