天津4种特色引进家禽大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验

李海花，白朋勋 *，张　莉，赵向华

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381)



兽医临床

天津4种特色引进家禽大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验

李海花1,2，白朋勋1,2*，张莉1,2，赵向华1,2

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381)

为了解天津几种引进的特色家禽致病性大肠埃希菌的流行情况，对引进的矮脚鸡、苏秦绿壳蛋鸡、大围山微型鸡和泰和乌骨鸡4个品种患腹泻病鸡的病料进行细菌学检验和药敏试验，经分离培养、染色镜检、生化试验、毒力基因ChuA鉴定、血清学试验和动物试验，共分离出9株鸡大肠埃希菌，其中从5株中能够检出ChuA毒力基因，这5株菌分别为O2、O78和O88，有3种血清型。动物试验结果表明，携带ChuA基因的5株菌均具有致病性，且毒力不同，其中从矮脚鸡分离的毒株毒力最强，致死率为100%。药敏试验结果表明，5株致病性大肠埃希菌对链霉素、阿莫西林/克拉维酸敏感，对磷霉素和环丙沙星均存在不同程度的耐药现象，其中对庆大霉素、头孢唑啉和氨苄西林严重耐药，研究结果为鸡大肠杆菌病防控提供了参考。

特色家禽；大肠埃希菌；分离；鉴定；耐药性

禽大肠杆菌病是指由禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的一种急性或慢性细菌性传染病，该病可通过大肠埃希菌污染的饮水、饲料及环境，经呼吸道和消化道引起鸡感染。临床症状有多种表现形式，主要包括大肠埃希菌败血病、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、全眼球炎及肉芽肿等[1]。大肠埃希菌血清型较多，已经确定的大肠埃希菌O抗原有173种，我国报道的APEC血清型主要有O1、O2、O5、O7、O78、O103等[2]。由于血清型之间交叉保护力低，临床对禽大肠杆菌病的预防和治疗主要依靠抗菌类药物。目前，养殖场在饲料添加剂及疾病治疗过程中滥用抗菌药物造成了大肠埃希菌的耐药菌株不断产生，使药物治疗无效，导致鸡大肠杆菌病普遍多发，给养禽业造成了巨大的经济损失。

近几年，天津地区引进了一些特色家禽品种，但是对这些引进的特色家禽大肠埃希菌的流行情况目前还不清楚。为了更好地防控特色家禽大肠杆菌病，给该病的防控提供可靠依据，本研究从引进的矮脚鸡、苏秦绿壳蛋鸡、大围山微型鸡和泰和乌骨鸡4个品种的疑似大肠埃希菌病料中进行大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性监测和分析，以期为天津地区特色家禽大肠埃希菌的防治提供参考，减少该病带来的损失。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源与采集23份病料来自天津某农业生态园的病死矮脚鸡、苏秦绿壳蛋鸡、大围山微型鸡和泰和乌骨鸡，无菌操作采集病死鸡的心、肝、脾等组织。

1.1.2培养基及试剂营养肉汤、营养琼脂、伊红美蓝、麦康凯培养基、大肠埃希菌生化试验微量发酵管，杭州天和微生物试剂有限公司产品；大肠埃希菌O抗原定型诊断血清，中国兽医药品监察所提供；dNTPs(2.5 mmol/L each)、TaqDNA polymerase，天根生化科技(北京)有限公司产品;GoldView核酸染料，赛百盛公司产品;DNA Marker DL 2 000 ，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3药敏纸片链霉素(10 g/片)、磷霉素(200 g/片)、阿莫西林/克拉维酸(20/10 g/片)、庆大霉素(10 g/片)、环丙沙星(5 g/片)、头孢唑啉(30 g/片)、氨苄西林(10 g/片)，杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4PCR引物采用曲志娜等[3]报道的毒力基因ChuA引物序列(ChuA-F：5′-GACGAACCAACGGTCAGGA-3′，ChuA-R：5′-TGCCGCCAGTACCAA- AGACA-3′)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.5试验用动物60只1日龄普通海兰褐蛋鸡商品代公雏，购自香河金佳种鸡场。

1.2方法

1.2.1细菌分离培养及镜检在采集的病料中取小块内部组织放在营养肉汤培养基中，37℃培养24 h；将有细菌生长的培养物分别划线接种于麦康凯和伊红美蓝培养基，37℃培养24 h；挑取典型菌落涂片，进行革兰染色镜检，观察分离菌形态特征，同时进行细菌纯培养。

1.2.2生化试验根据分离菌的培养特征、染色特点和形态特征，将初步筛选符合大肠埃希菌的纯培养物分别接种于生化反应管中，进行生化鉴定试验[4]。

1.2.3PCR检测大肠埃希菌ChuA毒力基因向灭菌过的PCR管加菌液3 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L each)0.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL(10 pmol/L)，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，补加DEPC处理的灭菌水至25 μL。反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 25 s，共33个循环；72℃ 5 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用20 g/L(琼脂糖/水)的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统下观察扩增结果。

1.2.4血清学试验将5株ChuA基因PCR鉴定为阳性分离菌分别均匀涂布于普通琼脂培养基，37℃培养24 h，用0.5 mL/100 mL(石碳酸/生理盐水)的石碳酸生理盐水冲洗菌苔，制成浓稠菌悬液。121℃高压灭菌2 h，5 000 r/min离心10 min，用麦氏比浊管调节细菌数约为1×109CFU/mL，再加入10 g/L(结晶紫/水)的结晶紫水溶液染色，即制成大肠埃希菌O抗原[1]。采用玻板凝集试验对所有分离菌株进行血清型鉴定[1]。

1.2.5雏鸡致病性试验用大肠埃希菌的制备将5株ChuA基因PCR鉴定为阳性分离菌分别接种营养肉汤培养液，置37℃过夜振荡培养后，按照1∶100转接新鲜营养肉汤培养液中，继续培养2 h，3 000 r/min 4℃离心收集菌体，用9 g/L(氯化钠/水)的氯化钠溶液洗涤2次后，菌沉淀重悬于生理盐水中。分别对5株菌进行倍比稀释，接种营养琼脂固体培养基，大肠埃希菌培养16 h后进行CFU计数，确定大肠埃希菌的浓度。

1.2.6动物致病性试验将60只雏鸡随机分为6组，即对照组和5个试验组，每组10只。按照正常饲养标准在无菌动物房隔离饲养3日，雏鸡均正常。调整菌液浓度，试验组雏鸡按0.2 mL/只(含菌量1×109CFU/mL)的剂量腹腔注射菌悬液，对照组则注射9 g/L(氯化钠/水)的氯化钠溶液(0.2 mL/只)。接种后隔离饲养7 d，观察雏鸡发病和死亡情况。发病死亡雏鸡取肝、脾做细菌回收试验。

1.2.7药敏试验 取5株分离的致病性大肠埃希菌，通过纸片琼脂扩散法测定其对链霉素、磷霉素等7种临床常用抗菌药物的敏感性。

2　结果

2.1细菌分离培养及形态染色结果

从4个品种的病鸡的病料中共分离到9株疑似大肠埃希菌。分离菌在麦康凯培养基上形成表面光滑、湿润、稍隆起的粉红色菌落；在伊红美蓝琼脂培养基上形成紫黑色菌落，带金属光泽。挑取单个典型菌落染色镜检，可见散在或成对存在的红色革兰阴性短杆菌。

2.2生化试验结果

分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇；对蔗糖和乳糖的发酵，不同菌株之间存在差异；MR试验阳性；VP试验阴性；枸橼酸盐阴性；硫化氢阴性；尿素酶阴性、靛基质阳性。根据分离培养、染色镜检及生化鉴定结果判断可疑菌均为大肠埃希菌。

2.3ChuA基因鉴定结果

本研究对分离到的9株大肠埃希菌的毒力岛基因ChuA进行了PCR检测(图1)，其中第1、4、6、7、9泳道分别扩增到特异性条带，大小均约为279 bp，第2、3、5泳道均扩增到一些非特异的条带，第8泳道无扩增产物。由此可知，分离的9株菌中有5株检出ChuA基因，应该属于致病性大肠埃希菌，这5株菌分别对应的是1、4、6、7、9号分离菌。其中1#、4#、6#和9#、7#菌株分别从苏秦绿壳蛋鸡、泰和乌骨鸡、围山微型鸡和矮脚鸡病料中分离得到。

2.4血清学试验结果

血清学试验结果显示，5株致病性大肠埃希菌分属于3种血清型，其中1#分离株为O2型，4#、6#和9#分离株为O78型，7#分离株为O88型。

2.5动物致病性试验结果

结果见表1。由表1可以看出，用血清型确定的5株分离菌分别接种3日龄雏鸡，试验组先后于不同时间发病和死亡。试验组雏鸡在接种约3 h后开始发病，出现精神沉郁，食欲减退，扎堆闭眼，两翼下垂，不愿走动；6 h～8 h后个别鸡出现拉水样稀便，部分鸡开始死亡；多数试验组鸡在12 h后拉水样稀便或脓样稀便，严重者拉血便。死亡率各组有差异，尤其是7#菌接种组最高达100%。综合死亡时间考虑，这5株菌的致病性由大到小依次是7#、4#、9#、1#、6#。生理盐水对照组则无死亡。剖检死亡的雏鸡，主要病理变化为肝、脾肿大，肝脏变黄、质脆、严重者出现包心包肝现象。肠壁变薄，严重者有出血。部分死亡鸡肾脏出血坏死。无菌采取病死鸡的肝脏与脾脏，划线于麦康凯琼脂平板上，均回收到接种的大肠埃希菌。对照组7 d后剖检未见明显肉眼变化，从肝、脾等处也未分离出细菌。

2.6药敏试验结果

药敏试验结果见表2。分离鉴定的5株致病性大肠埃希菌对7种药物出现不同程度的耐药性。7种药物的耐药率由大到小依次为庆大霉素80%(4/5)、头孢唑啉80%(4/5)、氨苄西林80%(4/5)、磷霉素40%(2/5)、环丙沙星40%(2/5)、链霉素0%(0/5)、阿莫西林/克拉维酸0%(0/5)。

M.DNA 标准DL 2 000; 1～9.分别对应1#～9#大肠埃希菌分离株

菌株Strians血清型Serotypes时间/hTime6121824364872168死亡总数Totaldeathes病死率/%Mortality1#O2012110106604#O78130201018806#O78002101105507#O8822031110101009#O7801212011880对照组Control/000000000

表2　药敏试验结果

注：“S”表示敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示耐药。

Note：“S”means sensitivity；“I”means intermediate sensitive；“R”means resistance.

3　讨论

通过分离培养和生化试验，从23份特色家禽疑似病料中分离鉴定出鸡大肠埃希菌9株，平均分离率为39.13%(9/23)。PCR和致病性试验表明，5株分离菌含有致病性基因ChuA，占分离菌的55.56%(5/9)，说明鸡大肠杆菌病在天津4种引进的特色家禽中普遍存在。

禽大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌引起的家禽常见细菌性传染病，大肠埃希菌血清型众多，我国已经分离鉴定的禽致病性大肠埃希菌血清型有70余种，并且不同地区优势血清型差异明显[3]。宁夏地区优势血清型为O14、O15、O24、O143和O157[4]，河北优势血清型为O78、O65、O1、O93和O14[5]，湖南优势血清型为O78、O1、O2和O55[6]，江苏扬州优势血清型为O78、O2、O127、O18和O1[7]，天津地区优势血清型为O78、O88、O2、O45、O53和O145[8]。本次从几种特色家禽中分离到的5株致病性大肠埃希菌血清型有O2、O78和O88，与天津地区优势血清型一致。说明大肠埃希菌的血清型虽然复杂，但是仍然具有稳定的地区优势血清型，为该生态园控制大肠杆菌病提供了理论依据。

近年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，不仅严重危害了动物食品安全，而且还导致耐药菌株的出现，尤其是广谱及超广谱抗菌药物不加控制的使用，更可能是造成耐药菌株迅速增加的重要原因[3]。本试验分离的鸡大肠埃希菌对7种药物有不同程度的耐药性、多重耐药及交叉耐药严重。其中，分离菌株对庆大霉素、头孢唑林和氨苄西林严重耐药，对链霉素和阿莫西林/克拉维酸敏感。因此，该生态园在治疗鸡大肠杆菌病时应首选链霉素和阿莫西林/克拉维酸，避开耐药药物，避免盲目用药，减少不必要的经济损失。

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[3]陈晓浪,成大荣,朱善元,等.鸡大肠杆菌毒力因子的流行病学及药物敏感性分析[J].扬州大学学报,2010,31(3):1-6.

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[6]李先磊,吕点点,刘立超,等.湖南省岳阳市鸡源性大肠埃希菌血清型鉴定[J].安徽农业科学,2009,37(26):12574,12591.

[7]吴华俊,任文,周梅霞,等.扬州地区鸡病原性大肠埃希菌的分离与鉴定[J].现代农业科技,2009(15):306-307.

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Escherichia coli in Four Imported Characteristic Poultry in Tianjin

LI Hai-hua1,2, BAI Peng-xun1,2, ZHANG Li1,2, ZhAO Xiang-hua1,2

(1.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin,300381,China;2.TianjinEngineeringResearchCenterforLivestockandPoultryHealthBreeding,Tianjin,300381,China)

This research was performed to understand the pathogenicEscherichiacoliepidemic situation in several imported characteristic poultry in Tianjin.Bacteriological examination and drug susceptibility test of the pathogens were executed to the chicken diarrhea disease materials from four varieties, including Bantam,Su lvkedanji,Daweishan miniature chicken and Black-bone chicken. NineEscherichiacolistrains were isolated by isolating and culturing,morphological observation,biochemical test,identification of virulence gene ChuA,serological test and animal experiment.Among these isolated strains, only five strains carry ChuA gene,and they have three serotypes,O2，O78 and O88.The results of animal experiment showed that the isolated strains carring ChuA gene were pathogenicEscherichiacoliand the virulences were different.The strains from Bantam were the most virulent and the mortality rate was 100%.The drug susceptibility test showed that the five pathogenic strains were sensitive to streptomycin and amoxicillin/carat acid,but had different levels of resistance to phosphorus mold and ciprofloxacin,and the most of strains were serious resistant to gentamicin,cefazolin and ampicillin.This study provided a theoretical basis for the control of chicken colibacillosis.

characteristic poultry;Escherichiacoli; isolation; identification; drug resistance

2016-03-15

天津市科技计划项目(15ZXZYNC00090)

李海花(1981-)，女，河南周口人，助理研究员，博士，主要从事动物微生物学与免疫学研究。*通讯作者

S852.612

B

1007-5038(2016)08-0112-04