獭兔源铜绿假单胞菌的分离鉴定及药敏试验

孙鑫鹏，高善颂，韩先杰

(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)



獭兔源铜绿假单胞菌的分离鉴定及药敏试验

孙鑫鹏，高善颂，韩先杰*

(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)

为了确定某獭兔养殖场獭兔发病的主要病原菌，分析该病原菌的耐药性，本试验对青岛市某獭兔养殖场送检的病死兔进行病理剖检，并从肺脏中分离得到1株细菌，随后进行分离菌形态观察、生化试验、细菌16 S rRNA基因测序。该株分离菌为革兰阴性杆菌，博检革兰阴性细菌鉴定系统的生化鉴定结果为铜绿假单胞菌，细菌的16 S rRNA基因序列经同源性比较，与铜绿假单胞菌同源性为100%。药敏试验结果表明该株分离菌对多种头孢类、喹诺酮类药物高度敏感。细菌分离鉴定和药敏试验结果为临床用药治疗该病提供参考依据。

獭兔；铜绿假单胞菌；分离鉴定；药敏试验

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又名绿脓杆菌，为假单胞菌属细菌，具有重要的医学与兽医学意义。目前已有多种动物发生铜绿假单胞菌病的报道[1-6],它给这些动物的养殖生产造成了较大危害，但鲜有关于獭兔感染铜绿假单胞菌病的报道。2014年8月，青岛市某獭兔养殖场獭兔发病，患兔精神沉郁，食欲减退或废绝，呼吸困难，发病已持续2周左右，造成50余只獭兔死亡，给养殖场造成较大的经济损失。为探明病因，进一步做好该病的防治工作，本文对病死獭兔进行了致病菌分离鉴定与药敏试验，以期为养兔场控制该病提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料某獭兔场送检的病死獭兔，无菌采集具有明显病变的肺脏。

1.1.2主要试剂PCR试剂(10×PCR buffer、dNTPs、DNA Marker DL 2 000、ExTaq酶)，宝生物工程(大连)有限公司产品；博检革兰阴性细菌鉴定系统，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司产品；药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；营养琼脂、麦康凯琼脂、十六烷三甲基溴化铵琼脂，北京陆桥技术有限责任公司产品；绵羊鲜血琼脂平板(80 ml/L)为青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室自制。

1.1.3实验动物小鼠，体重约20 g，购自青岛大吴富城养殖有限公司；普通级大白兔，体重约2.0 kg，购自青岛康大兔业发展有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌的分离培养无菌操作从病死兔的肺脏中分离细菌，划线接种于普通营养琼脂平板、十六烷三甲基溴化铵琼脂平板、麦康凯琼脂平板和绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养18 h～24 h后观察。挑取单个菌落进行染色、镜检，观察细菌的形态。

1.2.2生化试验按照博检革兰阴性菌鉴定系统说明书对细菌纯培养物进行生化鉴定并在数据库系统中对细菌种属进行确认。

1.2.316 S rRNA基因的PCR扩增按照通用型柱式基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。参照文献报道的方法合成1对用于扩增细菌16 S rRNA基因序列的引物[7]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3′，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。以基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系(25 μL)：包括DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ExTaq酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，去离子水17.0 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 S，54℃ 30 S，72℃ 1.5 min，33个循环；72℃ 7 min；12℃终止反应。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4PCR产物测序与DNA序列分析纯化、回收PCR产物，送交宝生物工程(大连)有限公司测序，利用NCBI的Blast工具将分离菌的16 S rRNA的基因序列进行同源性比对。

1.2.5药敏试验参照Kirby-Bauer琼脂扩散法进行分离菌的药敏试验[8]，参照文献报道进行药物敏感性的判定[8-9]。

1.2.6动物试验将分离菌的纯培养物接种于LB肉汤中37℃培养18 h～24 h，并计算活菌数。选取3只健康小鼠，每只腹腔注射菌液4.5×107CFU(0.25 mL菌液)；另取3只体重相近的健康小白鼠，每只腹腔注射等量灭菌LB肉汤。小鼠攻毒后连续观察7天，记录其临床症状及死亡情况。选取6只健康普通级大白兔，3只腹腔注射菌液1.13×108CFU(2 mL菌液)，另3只实验兔腹腔注射等量的灭菌LB肉汤作为对照，试验兔攻毒后连续观察3 d，记录其死亡时间和病变。

2　结果

2.1细菌分离及形态观察

分离菌株37℃培养18 h～24 h后，在营养琼脂平板上形成中等大小的菌落，培养基显淡绿色，且具有特殊的芳香气味；在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上形成扁平、灰白色菌落；在麦康凯琼脂平板上形成无色、半透明的小菌落；在血液琼脂平板上，形成中心较暗、有溶血环的灰色大菌落。分离出的细菌纯培养物接种于LB肉汤中37℃培养18 h～24 h后，菌液呈绿色。细菌培养物经革兰染色，在光学显微镜下可见多呈单个排列、中等大小的革兰阴性杆菌。

2.2生化试验结果

博检革兰阴性细菌鉴定系统生化试验结果见表1，将细菌生化试验结果在线输入“博检革兰阴性细菌鉴定系统”，结果显示“id%=98.16，T=0.98，R=59.98，铜绿假单胞菌，此鉴定结果可信赖”。

表1　分离菌株的生化试验结果

注：“+”阳性；“-”.阴性。

Note:"+" positive;"-" negative.

2.3分离菌16 S rRNA基因的PCR扩增

分离菌16 S rRNA基因序列的PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 500 bp左右出现目的条带(图1)，与预期大小相符。

2.4基因测序分析

利用NCBI的BLAST工具与数据库中登录的序列进行了同源性比对分析，结果显示该菌株与铜绿假单胞菌序列(GenBank序列号KM386632)同源性为100%，因此可确定分离菌株为铜绿假单胞菌。

2.5药敏试验

分离菌各种药敏纸片的抑菌直径测量结果见表2。结果表明该株分离菌对头孢他啶、环丙沙星等多种药物高度敏感，对恩诺沙星和新霉素中度敏感，对卡那霉素等药物耐药。

M.DNA标准DL 2 000;1.分离菌；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Isolated bacterial strain;2.Negative control

图1　PCR扩增分离菌16 S rRNA基因结果

注：S.高度敏感；I.中介；R.耐药。

Note:S.Sensitive;I.Intermediate;R.Resistance.

2.6动物试验

在动物试验中，试验组小鼠表现为精神沉郁、聚堆、很少活动，在24 h～48 h内全部死亡。对照组小鼠经连续观察7 d，全部健康存活。死亡小鼠眼观主要病变为肺脏出血，肝脏、脾脏肿大，肠道黏膜充血。在大白兔回归试验中，试验组兔接种菌液后10 h开始表现体温升高，精神萎靡，不愿活动，呼吸急促、鼻孔流出分泌物，与发病獭兔临床症状基本相似。接种细菌后约20 h死亡1只，其余2只在接种细菌后约32 h全部死亡。对照组兔在试验观察期间均健康存活。死亡兔眼观病变主要为肺脏表面有出血点，肝脏肿大，小肠肠腔充满液状内容物，与送检病死獭兔剖检病变大体相同。取死亡小鼠、兔的肺、肝接种营养琼脂平板与十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，均分离到与原接种菌同样的细菌。

3　讨论

铜绿假单胞菌是一种人兽感染的重要条件致病菌，它广泛分布于水、空气、土壤等自然环境及正常人、畜的皮肤、肠道和呼吸道，可在创伤局部感染化脓，也可全身感染引起败血症[10]。本研究的病料来自2014年8月青岛某獭兔养殖场的发病獭兔，临床检查发现发病獭兔后肢均有皮肤破溃，有的已经形成痂皮。剖检病变主要为肺肿胀、出血，肝脏和肾脏肿胀、淤血，小肠充满液状内容物。根据临床症状、解剖病变结果，进一步结合细菌分离、生化试验和分子生物学技术鉴定，最终确诊为铜绿假单胞菌感染，分离菌对小鼠和实验兔有一定的致病力。

从发病獭兔分离的铜绿假单胞菌对多种头孢类药物、多种喹诺酮类药物和氨基糖苷类药物高度敏感，对恩诺沙星和新霉素中度敏感，对卡那霉素等药物耐药。建议养殖场对发病獭兔按照3 mg/kg～5 mg/kg肌注庆大霉素，每天1次，连用3 d；其他獭兔用左氧氟沙星(25 mg/L水)全群饮水投药。同时用新洁尔灭进行消毒，每天1次，连续消毒5 d～7 d。经过采取上述措施，3 d左右患病兔食欲、精神有所好转，没有出现新的发病病例。

消化道、呼吸道和伤口是兔铜绿假单胞菌病主要的感染途径[11]。对发病兔的临床检查，发现发病獭兔后肢均有皮肤破溃，据此推测该场獭兔铜绿假单胞菌病的感染和传播途径很可能是后肢的皮肤伤口。獭兔的生物学因素、獭兔的体型、兔舍的环境和兔笼底板结构等因素均可引起獭兔后肢发生皮肤破溃，进而增加了感染某些细菌(如铜绿假单胞菌、葡萄球菌等)的机会。为了有效地预防獭兔的铜绿假单胞菌病，建议养兔场主要采取以下措施：① 平时加强饲养管理，保持笼舍的清洁卫生；② 选用表面平整、无锐利物的兔笼底板；③ 当发现家兔局部皮肤破溃时，要及早对伤口进行处理，根据伤口的情况分别采取消毒药清洗、涂擦抗生素软膏、消毒纱布包扎等措施，防止铜绿假单胞菌经伤口感染。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofPseudomonasaeruginosafrom Rex Rabbits

SUN Xin-peng，GAO Shan-song，HAN Xian-jie

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agriculture University， Qingdao，Shandong，266109，China)

In order to identify the main bacterial pathogens from the diseased Rex rabbits at a farm and analyze the drug sensitivity,some diseased Rex rabbits from one farm in Qingdao were dissected.A bacterial strain was isolated from the lungs of the Rex rabbits,and was identified by morphological characteristics,biochemical tests and 16 S rRNA sequencing.The bacterial isolate was Gram-negative bacillus,and was identified asPseudomonasaeruginosaby Bojian Gram-negative bacteria identification system.The 16 S rRNA sequence of the bacteria shared 100% homology withPseudomonasaeruginosaby the method of homology comparison.The drug sensitivity test indicated that the bacterial isolate was highly sensitive to most kinds of the cephalosporins and aminoglycosides.The result can provide a reference for clinical medication to treat thePseudomonasaeruginosainfection.

Rex rabbit；Pseudomonasaeruginosa；isolation and identification；drug sensitivity test

2015-11-03

山东省现代农业产业技术体系毛皮动物产业创新团队项目(SDAIT-18-011-12)；山东省应用型人才培养特色名校建设大学生科技创新项目

孙鑫鹏(1994-)，男，山东烟台人，本科生。*通讯作者

S852.617

B

1007-5038(2016)08-0128-04