拟南芥WHIRLY2基因超表达引起拟南芥角果发育异常的分子细胞学分析

黄晨星, 任育军, 李燕云, 缪　颖

(福建农林大学生命科学学院分子细胞与系统生物学中心，福建 福州 350002)



拟南芥WHIRLY2基因超表达引起拟南芥角果发育异常的分子细胞学分析

黄晨星, 任育军, 李燕云, 缪颖

(福建农林大学生命科学学院分子细胞与系统生物学中心，福建 福州 350002)

通过构建拟南芥WHIRLY2基因超表达植株和鉴定这个基因的突变体，对WHIRLY2基因调控拟南芥角果的发育过程进行了分析.表型观察结果显示过量表达WHIRLY2基因的植株角果发育异常，出现变黄、干瘪和早衰现象，角果果皮细胞中叶绿体的数量明显比野生型少，叶绿体中淀粉粒的数目比野生型明显增多.进一步对角果发育、能量代谢、线粒体基因组稳定、叶绿体淀粉粒代谢相关基因的表达丰度进行qRT-PCR分析，发现WHIRLY2超表达植株角果中与线粒体能量代谢相关的nad1、cytc382、rad50和同时作用于线粒体和叶绿体的atp9基因的表达发生变化.通过线粒体基因组的结构分析和蛋白质凝胶迁移试验，发现WHIRLY2蛋白可以结合在线粒体基因组的nad1和cytc382基因启动子的4个端粒重复序列AAAATCCCC上，推测WHIRLY2可能通过调控nad1和cytc382基因的转录从而参与角果发育的调控.

拟南芥; 角果发育; 拟南芥WHIRLY2; nad1; cytc382

WHIRLY蛋白家族是一类双定位于细胞器和细胞核的单链DNA结合蛋白的小家族[1].在拟南芥中它有3个成员，WHIRLY1和WHIRLY3双定位于叶绿体和细胞核中，而WHIRLY2双定位于线粒体和细胞核中[1].首个被鉴定出的WHIRLY家族成员为p24，Desveauxetal[2]从马铃薯(Solanum tuberosum)中将其分离出来，并发现它是转录激活因子PBF-2 (PR-10abindingfactor2)，可以与诱导应答元件ERE(elicitorresponseelement)以单链形式结合从而调节马铃薯病原相关基因pr-10a的表达，传递抗病信号，后被命名为StWHY1.随后，在众多植物中均发现WHIRLY家族的存在[1].进一步研究发现，WHIRLY家族在不同生物进程中行使不同的功能.鉴定结果表明WHIRLY1除了能调控病原相关基因的表达外，在细胞核中还能够维持端粒长度的稳态，能够结合在胁迫相关基因的启动子上，调控衰老相关基因的表达.在拟南芥中WHIRLY蛋白还参与维持细胞器基因组的稳定性[3].

WHIRLY2是WHIRLY家族的成员之一[2]，早期对WHIRLY2功能的研究发现在拟南芥中超表达全长的WHIRLY2会导致叶片早衰和角果发育变小，推测这与线粒体的呼吸链有关[4,5].最近，Caietal[6]发现花粉管中WHIRLY2与线粒体的基因组的稳定性与DNA数量有关.本研究基于超表达和敲除WHIRLY2突变体的表型观察，从石蜡切片、细胞超微结构以及分子水平上揭示WHIRLY2对角果发育调控的分子细胞生物学机理，为WHIRLY2功能的研究提供依据.

1　材料与方法

1.1材料

野生型拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsis thalianaColumbia)均匀铺种在湿滤纸上，4 ℃春化2d后移至人工气候室中萌发1d，转至蛭石上生长.培养温度为22.5 ℃，湿度为60%，光周期为13h光照∶11h黑暗，光强100μmol·s-1·m-2.植株生长至4周以及7周后分别获取莲座叶以及角果，液氮速冻后保存于-80 ℃备用.WHIRLY2的T-DNA插入突变体Salk_118900和Salk_118907购自Salk研究所，并根据网站提供的引物序列进行基因组插入筛选(http://signal.salk.edu/)，获得WHIRLY2T-DNA插入敲除型纯合突变体(why2).

1.2方法

1.2.1拟南芥WHIRLY2基因超表达载体的构建、转化及转基因植株的鉴定应用5′端引物加CACC和3′端引物加FLAG标签序列，从拟南芥野生型cDNA库中扩增全长WHIRLY2编码序列，利用Gateway系统，将扩增片段克隆入pENTR-TOPO载体中，测序验证WHIRLY2编码序列的正确性；然后和终端超表达载体pB2WG7进行LR重组反应，筛选获得阳性克隆，电激转化农杆菌GV3101，采用浸花法侵染WHIRLY2敲除型突变体拟南芥未开放的花蕾.T1代苗期用0.1% (体积分数)Basta筛选获得10个以上阳性株系，T2代进行遗传分离试验，在T3代获得纯合超表达转基因(oe-WHY2)植株，并用于表型观察和后续试验.

1.2.2拟南芥T-DNA插入突变体的Northernblot鉴定利用TRIzol试剂提取4周龄莲座叶的总RNA，电泳检测完整性后于-80 ℃保存.取10μg左右总RNA，根据Miaoetal的方法[5]，经甲醛变性胶电泳、转膜、预杂交、杂交和洗脱，最后在PhosphateImage上通过X胶片曝光获得结果.探针为32P标记的WHIRLY2全长编码序列.

1.2.3组织切片技术和超微结构观察剪取温室中生长7周龄植株的角果投入FAA固定液(100mLFAA中含38%(体积分数)甲醛5mL、冰醋酸5mL、70%(体积分数)酒精90mL)中固定12h；而后进行乙醇梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片，切片厚度5～8μm，脱蜡后甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察角果组织的结构并拍照.

取上述新鲜角果投入2.5%(体积分数)戊二醛中固定2h，磷酸缓冲液漂洗后用1%(体积分数)锇酸继续固定1h，利用磷酸缓冲液漂洗后经丙酮梯度脱水.组织经环氧树脂包埋后手工修整，然后利用超薄切片机进行超薄切片；醋酸铀染色10～20min后电镜观察并拍照.

1.2.4qRT-PCR试验从oe-WHY2、why2突变体和野生型7周植株的角果中提取的总RNA经DNaseⅠ消化，然后利用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(Thermo)进行cDNA第1链的合成，再采用CFXConnectTMReal-Time系统(BIO-RAD)对相关基因进行实时定量PCR扩增和检测.反应体系为15μL，实时定量PCR反应的具体步骤参考北京康为生物公司(CWBIO)生产的UltraSYBRMixture(withROX)试剂(CW0956)说明书，每管加入0.2μmol·L-1的扩增引物以及20ng合成的第1链cDNA.拟南芥Actin2基因作为内参基因，其它基因的表达参照Actin2计算相对表达量，并将野生型中相应基因的表达设为1，利用3次生物学重复和3次技术重复得到的结果计算平均值和标准差.qRT-PCR中所用的引物为.

mre11-FP：AACAAATCTCAGCCTCGGGTTAC.mre11-RP：AGAAGTTGTTCCGCTTGAGAGGTC.rad50-FP：CCCGCTCTTACAGCTACAAGGTTC.rad50-RP：TTGACCTGCACTGCATCTTCCTC.nbs1-FP：CTTCACTGATACCACCATCCGTTG.nbs1-RP：GCTTCAGAATCCGCTACCACTG.phs1-FP：GCAGGCCAAACAACTGTGAAGC.phs1-RP：CGTGCTACCTACACATCGATCTCC.atp9-FP：CTCCGTGGGTATAAGATCGCAAAG.atp9-RP：TCGTCGATTCTTACCCTCGTTCC.nad1-FP：ACCAGATCAAAGGCTGGCAT.nad1-RP：TCCTGCATTGCTTGACACCA.cytc382-FP：TTGACGGAGCTCTTGGCATT.cytc382-RP：ATTCTGCAAGCGGTTCGGTA.

1.2.5凝胶迁移试验(EMSA)参考Miaoetal抽提拟南芥总蛋白的方法[7]提取野生型、oe-WHY2和why2突变体角果中的总蛋白，应用Bradford法测定总蛋白的浓度.体外合成线粒体nad1启动子区端粒重复序列的编码区(tel-cs)、非编码区(tel-ncs)、端粒双链(tel-ds)、转录的RNA(tel-RNA)探针，经PCR扩增后纯化回收.根据Miaoetal的方法[8]进行凝胶迁移电泳，探针用带32P标记的ATP进行T4-ligase法标记.WHIRLY2蛋白与标记的探针在10μL结合体系中室温孵育30min后，置于0.04g·mL-1非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，同时分别进行竞争性试验.电泳结束后紫外交联5～10min，直接曝光检测.

2　结果与分析

2.1WHIRLY2超表达转基因植株的构建和敲除型突变体植株的获得与验证

为了进一步考察WHIRLY2蛋白在拟南芥角果发育过程中的功能，本试验构建了WHIRLY2超表达载体，转化并获得10个阳性转基因植株，对T2代进行遗传分离试验，并在T3获得了表达WHIRLY2的纯合体转基因株系(oe-WHY2).同时从Salk研究所购买了2个不同T-DNA插入位置的WHIRLY2敲除突变体why2-1和why2-2(图1).Northern杂交的结果表明这2个突变体中WHIRLY2的mRNA水平几乎检测不出来，而野生型植株中可以检测到600bp的mRNA信号(图2)，与WHIRLY2mRNA的一致.半定量PCR的结果进一步表明why2突变体中WHIRLY2的表达水平明显比野生型低，而3个超表达的纯合系(oe-L1、oe-L2和oe-L3)中WHIRLY2表达水平则明显比野生型高(图2).

2.2WHIRLY2对拟南芥角果发育及果皮细胞中叶绿体和质体内淀粉粒数量的影响

野生型、oe-WHY2和why2植株在光强100 μmol·s-1·m-2、温度22.5 ℃和湿度60%的条件下生长至第7周，观察3种WHIRLY2不同表达背景下角果的发育状态，发现oe-WHY2植株的角果发育异常，出现干瘪、黄化和早衰现象，而why2的角果与野生型相比并未发现异常(图3).进一步对oe-WHY2、why2和野生型的角果进行组织切片观察，发现oe-WHY2发育异常的角果的果皮细胞内叶绿体的数目相对于野生型呈极显著下降(图4、5)，而why2突变体的角果与野生型比较变化不大，其他组织的结构也没有显著变化(图4).电镜超微结构观察结果表明，oe-WHY2异常发育的角果的果皮细胞叶绿体基粒类囊体和基质类囊体以及线粒体都未发生结构性改变，但叶绿体中淀粉粒累积的数量比野生型显著增多，而why2突变体角果的果皮细胞的叶绿体内淀粉粒数目比野生型略有减少，对5个细胞10个叶绿体的统计分析结果表明没有显著性差异(图4、5).因此WHIRLY2超表达引起的角果发育异常可能与叶绿体的稳定性以及叶绿体中淀粉的合成代谢有关.

2.3WHIRLY2蛋白对角果发育基因表达的影响

基于研究结果[4，6]，本研究对近60个与能量代谢、角果发育、线粒体基因组稳定以及叶绿体淀粉代谢相关的基因在野生型、oe-WHY2和why2的角果中的表达变化进行实时定量PCR分析，其中nad1、cytc382和rad50三个基因的转录水平在超表达的角果中呈显著性上调，在敲除型的角果中呈明显下调；atp9基因的转录水平在超表达和敲除型中都表现为上调表达(图7).而nad1、ctyc382和atp9都是线粒体基因组编码的基因.

2.4WHIRLY2蛋白结合线粒体基因组的单链端粒重复序列

采用WHIRLY2蛋白的结合序列与整个线粒体基因组序列进行比对，考察nad1、cytc382和atp9三个基因的启动子区域，发现nad1和ctyc382共享相同的启动子区域，而且启动子区域有4个重复的端粒序列(图7).因此通过人工合成4个重复端粒序列的DNA编码链(4×Tel-cd)、非编码链(4×Tel-ncd)和RNA链(4×Tel-RNA),并提取WHIRLY2超表达和敲除型突变体植株叶片的蛋白质进行凝聚电泳迁移试验.结果表明，WHIRLY2超表达植株的蛋白与4×Tel-cd片段温浴后可形成特异的复合物，而该复合物在why2中没有形成.由此推测WHIRLY2能结合在线粒体基因组4×Tel上，调控下游基因nad1和cytc382基因的表达.

3　讨论

本研究发现超表达WHIRLY2植株的角果发育明显异常，出现干瘪、黄化和早衰现象，从细胞学观察结果可知线粒体并没有发生结构性变化，这点与Maréchal et al[4]的研究结果相似.但Maréchal et al[4]仅从呼吸电子传递系统开展研究，指出其原因是呼吸电子传递系统引起线粒体功能下降.而本研究通过细胞学组织切片和超微结构观察，发现角果的果皮细胞叶绿体数目显著减少，叶绿体内淀粉粒却明显增加.进一步研究与角果发育、能量代谢、线粒体基因组稳定相关的基因以及与叶绿体淀粉粒代谢相关基因的表达，发现超表达WHIRLY2明显上调了nad1、细胞色素cytc-382、rad50以及atp9基因的表达，而敲除WHIRLY2则明显下调了nad1、细胞色素cytc-382和rad50基因的表达.atp9基因的表达在超表达和敲除型植株中都表现为上调，这表明WHIRLY2对atp9基因表达的影响是间接、多途径的.一方面，WHIRLY2在线粒体中通过影响atp9基因的表达而影响内含子RNA的剪接和编辑，从而影响线粒体基因组的稳定性；另一方面WHIRLY2在叶绿体中通过影响叶绿体碳代谢途径几个相关基因如淀粉磷酸化酶的表达，反过来调控atp9基因的表达水平.而nad1、细胞色素cytc-382和atp9都是线粒体基因组编码的基因，而且nad1和细胞色素cytc-382基因共享相同的启动子，启动子区域有4个重复端粒序列(图7).EMSA试验也证明WHIRLY2蛋白可以结合在单链4个重复端粒序列的启动子区域和4个重复端粒的RNA序列(图8)，推测这直接影响nad1和细胞色素cytc-382基因的表达，从而影响线粒体的活力.

[1] KRAUSE K, KILBIENSKI I, MULISCH M, et al. DNA-binding proteins of the Whirly family inArabidopsisthalianaare targeted to the organelles[J]. FEBS Lett, 2005,579:3 707-3 712.

[2] DESVEAUX D, DESPRÉS C, JOYEUX A, et al. PBF-2 is a novel single-stranded DNA binding factor implicated in PR-10a gene activation in potato[J]. Plant Cell, 2000,12:1 477-1 489.

[3] 林文芳,任育军,缪颖.植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展[J].植物生理学报,2014,9:1 274-1 284.

[4] MARÉCHAL A, PARENT J S, SABAR M, et al. Overexpression of mtDNA-associated AtWhy2 compromises mitochondrial function[J]. BMC Plant Biology, 2008,8(1):1-15.

[5] YOSHIDA S, ITO M, NISHIDA I, et al. Isolation and RNA gel blot analysis of genes that could serve as potential molecular markers for leaf senescence inArabidopsisthaliana[J]. Plant Cell Physiol, 2001,42(2):170-178.

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[8] MIAO Y, JIANG J, REN Y, et al. The single-stranded DNA-binding protein WHIRLY1 represses WRKY53 expression and delays leaf senescence in a developmental stage-dependent manner inArabidopsis[J]. Plant Physiol, 2013,163:746-756.

(责任编辑:叶济蓉)

MolecularandcytologyanalysisofArabidopsissiliqueabnormaldevelopmentinducedbyWHIRLY2overexpression

HUANGChenxing,RENYujun,LIYanyun,MIAOYing

(CenterforMolecularCellandSystemsBiology,CollegeofLifeSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

ToelucidatetheroleofWHIRLY2inmitochondrialactivity,overexpressingandknockoutlinesofArabidopsis thalianaColumbiawerecultured.PhenotypeanalysisshowedthatsiliqueofWHIRLY2-overexpressinglinebecamedry,yellowandshowedearlysenescence.DecreasingchloroplastnumberandincreasingstarchgranulenumberweredetectedinpericarpcellofWHIRLY2mutantscomparedtowild-typeplant.SubsequentquantitativeRT-PCRwereconductedtoanalyzeexpressionlevelsofgenesrelatedtosiliquedevelopment,energymetabolism,stabilityofmitochondrialgenomeandchloroplastdifferentiationinWHIRLY2mutants.Resultsshowedthattranscriptionlevelsofgenesinvolvedinmitochondrialenergymetabolism,includingnad1, cytc382, rad50andatp9,wereincreasedinthesiliqueofWHIRLY2-overexpressinglines.MitochondrialgenomestructureandelectrophoreticmobilityshiftassaysrevealedthatWHIRLY2proteinwasabletobindtothe4×Telomererepeatsofpromoterregionofnad1andcytc382genes.ItsuggestedthatWHIRLY2mayinfluencemitochondrialactivityviageneexpressionofnad1andcytc382toregulatesiliquedevelopmentinArabidopsis.

Arabidopsis thalianaColumbia;siliquedevelopment; WHIRLY2; nad1; cytc382

2016-02-06

2016-03-28

国家自然科学基金资助项目(31470383、31400260);福建省“百人计划”基金资助项目(KXR14002A).

黄晨星(1987-),男,硕士.研究方向：植物细胞生物学.Email：hcx3444544@sina.com.通讯作者缪颖(1965-),女,教授,博士生导师.研究方向：植物分子细胞生物学.Email：ymiao@fafu.edu.cn.

Q291

A

1671-5470(2016)03-0277-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.007