不同比例混合样品对西瓜纯度分子标记鉴定的影响

王吉明，尚建立，李 娜，徐永阳，马双武

（中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009）

西瓜纯度鉴定在种质资源研究、新品种选育和生产应用上具有重要意义，传统的西瓜纯度鉴定方法为表型性状鉴定，通过观察西瓜表型性状在生长发育期的变化而对纯度做出判断，受环境影响较大，存在鉴定周期长、准确性差、鉴定效率低等局限性［1-6］，而同工酶鉴定多态性不够丰富，且有组织和器官特异性等缺点[7]。近年来随着以PCR为基础的分子标记技术的快速发展，不少作物实现了分子标记快速鉴定纯度，将纯度鉴定工作由田间转移到室内，极大地提高了鉴定效率。在西瓜作物上前人先后开展过利用RAPD、SRAP、SSR等分子标记技术进行纯度鉴定的研究［8-13］，其中基于全基因组测序信息开发的SSR核心引物为分子标记技术在西瓜纯度鉴定上的实际应用提供了重要的支持［14］。

利用分子标记进行纯度鉴定通常对样品逐株进行分析，而在西瓜杂交种子纯度鉴定工作中，杂株通常较少，如果通过将一定数量的单株混合后检测混合样品中是否存在杂株分子标记位点来对混合样品的整体纯度进行判定，可以大幅度减少鉴定工作量，如在小麦分子标记纯度鉴定研究上通过合理混合样品，将100粒种子的DNA合并为20个混合样本，使工作量减少了4/5［15］，从而显著提高了鉴定效率，但目前国内外在西瓜纯度鉴定研究上尚未有类似的报道，为此笔者对不同类型的西瓜样品混合后进行 dCaps（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，衍生型酶切扩增多态性序列）标记鉴定的比较研究，拟寻找合适的混合株数，为提高西瓜纯度的分子标记鉴定效率提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016年在中国农业科学院郑州果树研究所进行，材料来自西瓜甜瓜种质资源平台（国家西瓜甜瓜中期库）。以枯萎病抗性种质‘Su garlee’即“纯株”和枯萎病感病种质‘14CB11’即“杂株”为材料，分别取新鲜真叶叶片和干燥真叶叶片备用。干燥真叶制备方法为：取新鲜真叶后置于国家西瓜甜瓜中期库种质保存冷库中（温度5℃，相对湿度40%）低温干燥72 h后成为干燥真叶。

1.2 方法

通过在‘Sugarlee’样品（“纯株”）中添加不同比例的‘14CB11’样品（“杂株”），比较不同添加比例对分子标记纯度鉴定结果的影响。

1.2.1 叶片混合样品方法 按照表1进行不同比例的抗病材料和感病材料的真叶混合，其中新鲜真叶总混合样品质量分为0.1g和0.5g，干燥真叶总混合样品质量分为0.01g和0.05g，混合样品后提取DNA。

表1 西瓜叶片量混样比例表(杂株叶片量：总量混合叶片量)

1.2.2 DNA混合样品方法 取0.1g新鲜真叶提取DNA，稀释成100 ng·μL-1，按照感病材料提取DNA量占总混合 DNA 量的体积比为 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶100 进行 DNA 混合。

1.2.3 DNA提取方法 采用天根DNA提取试剂盒［天根生化科技(北京)有限公司生产］进行提取，提取方法以试剂盒操作说明书的步骤为主并略加改动，将操作说明书中第4步的GP2替换为预冷的异丙醇（0.7倍体积），采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度计检测DNA浓度，将最终浓度稀释到100 ng·μL-1左右。

1.2.4 dCaps反应 采用2×TaqMaster Mix（北京百泰客生物技术有限公司生产）进行PCR反应，反应体系为 25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板DNA 2.0μL，10 mol·L-1，上、下游混合引物 2μL，ddH2O 8.5μL；扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCaps引物为国内公开发表的抗枯萎病生理小种1紧密连锁的dCaps标记502124_fon[16]，该标记引物信息为：

上游引物序列为5′-AACACCACCCACTTTGGAGCTTCG-3′，下游引物序列为 5′-TTTTAGGGT GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

dCaps产物采用内切酶TaqI进行酶切，酶切识别位点为 T’CGA，酶切体系为：10×Buffer 1.5μL，限制内切酶 1.0μL；dCaps 扩增产物 5.0μL，ddH2O 7.5μL，总体系为 15.0μL。酶切程序为：65 ℃条件下酶切16 h，80℃条件变性20 min，4℃保存，限制性内切酶购自Fermentas公司。

2 结果与分析

全部混合样品的DNA经dCaps扩增后均电泳出116 bp的条带，该条带被酶切后能够产生94 bp的条带，即“纯株”抗病条带，如经酶切后仍电泳出116 bp条带，即“杂株”感病带，表明样品中混入的杂株被成功检测（图1）。

2.1 不同比例叶片混合样品

2.1.1不同比例新鲜真叶混合样品 根据电泳结果，在总量为0.1g新鲜真叶混合样品中，感病叶片量与混合叶片总量混合比例为1∶2时116 bp的感病条带最为清晰，随着混合样品比例的降低，116 bp条带逐渐模糊，但直到最低的1∶20混合样品比例时仍可以分辨出116 bp条带。

当真叶混合总量提高到0.5g时，感病叶片量与混合叶片总量比例为1∶5和1∶10时，感病116 bp电泳条带清晰可见，但当混合比例降低到1∶20时116 bp感病条带消失，即无法进行杂株位点鉴定。

图1 不同比例叶片混样的dCaps电泳结果

2.1.2 不同比例干燥真叶混合样品 在总量为0.01g干燥真叶混合样品中，感病叶片量与混合叶片总量比例为 1∶2、1∶5 和 1∶10 时 116 bp 条带清晰可见，当混合样品比例降低到1∶20时仍可以分辨出116 bp条带。

当干燥真叶混合总量提高到0.1g时，在1∶5和1∶10比例的混合样品中，116 bp电泳条带清晰可见，当混合样品比例降低到1∶20则变为弱条带，但是当混合样品比例降低到1∶100时，感病条带116 bp仍有模糊的痕迹。

2.2 不同比例DNA混合样品

提取的DNA经过不同比例混合后进行了dCaps反应，在1∶5和1∶10比例的混合样品中电泳出了清晰的116 bp条带，当混合样品比例降低到1∶20时变为弱带，直到混合样品比例降低到1∶50时弱带仍然存在，混合样品比例降低到1∶100时弱带才完全消失。

2.3 不同类型混合样品结果的比较

对干燥真叶混合样品结果与新鲜真叶混合样品结果进行比较发现，干燥真叶混合样品后杂株位点可检测的混合样品比例更低，如干燥真叶杂株混合样品比例为1∶20时杂株位点仍然可以识别，并且在1∶50仍有检测条带的痕迹，而新鲜真叶杂株混合样品比例为1∶20时杂株位点条带消失或模糊。

新鲜真叶经过DNA提取混合样品后，在1∶50时仍有可检测条带的痕迹，与干燥真叶混合样品效果类似，表明新鲜真叶经过干燥或DNA提取后再混合样品可以提高杂株检测灵敏度。

综合以上不同混合样品电泳结果分析，推荐杂株位点检测最低混合样品比例为1∶10，即10株可以为西瓜纯度分子鉴定的可靠混合株数。

3 讨论与结论

利用分子标记技术可以从DNA遗传角度对西瓜纯度进行分析和鉴定，能够最大程度地排除环境因素对鉴定结果的影响，相较于传统的田间表型性状观察鉴定具有明显优势，并且分子标记的技术特点具备了混合样品分析的可能，通过合理混合样品可以避免逐株进行分析，能够减少鉴定工作量、提高鉴定效率。笔者通过不同质量的新鲜真叶混合、干燥真叶混合以及提取的DNA样品混合，表明不同的样品混合可鉴别的最低比例不太相同，最低的鉴定比例为1∶50，即最大混合株数为50株，在该混合样品中只要存在1株杂株就可以识别出杂株的分子标记位点，一般的混合比例为1∶10，即混合株数为10株。综合鉴定的稳定性和可靠性，推荐混合株数为10株，这个混合样品数量与大豆混合样品研究结果相似[16]，可作为实际混合样品鉴定的参考混合株数，能够将鉴定工作量缩短10倍左右。

不同样品类型混合后鉴定的灵敏度不太一致，本试验结果表明，干燥真叶混合比新鲜真叶混合效果好，而提取后的DNA混合比干燥真叶混合效果好，出现这种情况可能与混合样品的均匀性有关，关于混合样品方式的优化有待进一步比较和研究。