肺癌中异常增高的RAD21的临床意义及潜在功能预测

谷学静，吴月明，高静

（辽宁医学院1.人体解剖学教研室；2.附属第三医院肿瘤科；3.附属第一医院超声科，辽宁 锦州 121001）

肺癌中异常增高的RAD21的临床意义及潜在功能预测

谷学静1，吴月明2，高静3

（辽宁医学院1.人体解剖学教研室；2.附属第三医院肿瘤科；3.附属第一医院超声科，辽宁 锦州 121001）

目的检测肺癌组织中RAD21（S.Pombe RAD21同系物）的表达水平，探讨其潜在临床意义及功能。方法采用Western blot和免疫组织化学方法检测肺癌组织中RAD21的表达水平；通过Oncom ine（肿瘤微阵列数据库）分析RAD21mRNA在肺癌中的表达情况；应用Kaplan-Meier分析RAD21的表达水平与肺癌患者预后的关系；采用基因集富集分析方法预测RAD21在肺癌中的功能。结果与癌旁组织相比，肺癌组织中RAD21蛋白的表达水平增高。Oncomine数据库结果显示，多个肺癌基因芯片中RAD21的mRNA水平明显增高（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，RAD21的表达水平与肺癌患者的生存时间存在相关性（P＜0.05）；基因集富集分析显示，RAD21主要富集于细胞凋亡与细胞周期调控相关的信号通路。结论肺癌中RAD21的表达水平可作为判断肺癌患者预后的生物标志物。RAD21可能通过调控细胞周期和凋亡参与肺癌的发生和发展。

肺癌；RAD21；预后；免疫组织化学

人RAD21基因位于染色体8q24.11，编码与DNA双链断裂修复有关的核内蛋白质，是粘连复合体的组成成员［1］。研究表明，RAD21基因不仅能够保持姐妹染色单体结合并确保正确的复制［2］，还参与了DNA双链断裂修复及减数分裂重组等过程［3，4］。研究显示，RAD21在结直肠癌［5，6］、子宫内膜癌［7］、乳腺癌［8，9］等多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤的发生发展、预后判断及治疗存在密切关联。本研究拟探讨RAD21基因在肺癌组织中的表达，并预测其在肺癌中的功能，探究该基因在肺癌发生发展中的作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源：25例肺癌及癌旁组织均来自辽宁医学院附属第一医院手术切除的肺癌及癌旁组织。其中，腺癌17例，鳞癌8例。组织均经含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液固定，常规石蜡包埋、切片，厚5 μm。全部诊断均经病理证实，术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。

1.1.2主要试剂：RAD21兔抗人多克隆抗体、β-actin鼠抗人单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；HRP标记的山羊抗兔二抗以及二氨基联苯胺（DAB）显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；辣根酶标记山羊抗鼠IgG二抗（美国Invitrogen公司）；蛋白预染标准参照物（美国Fermentas公司）。

1.2方法

1.2.1肺癌及癌旁组织中RAD21蛋白表达水平检测：向肺癌及癌旁组织中加入RIPA裂解液，静置20 min。4℃、12 000 r/min离心20 min，留取上清液，BCA法测定蛋白含量。电泳（100 V），转膜，5%BSA室温封闭1 h。加入兔抗人RAD21多克隆抗体（1∶800稀释），4℃孵育过夜，TBST洗脱3次，每次5 min。HRP标记的羊抗兔二抗（1∶5 000稀释）孵育1 h，TBST洗脱3次，每次5 min。ECL显色后X线曝光。采用β-actin作为内参。

1.2.2Oncomine数据库中RAD21的表达谱分析：在Oncomine数据库（http：//www.oncomine.com）中查询RAD21表达谱，先限定“Analysis Type：Lung Cancer vs Nornlal Analysis”，再输入基因名称RAD21，检索获得肺癌相关数据集。限定P＜0.001的过滤选项，View box plot。

1.2.3免疫组织化学染色：组织切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温15 min，枸橼酸盐微波修复，羊血清清蛋白封闭30 min。分别滴加兔抗RAD21多克隆抗体（1∶200稀释），湿盒中4℃过夜，加二抗37℃温箱孵育30 min，加SABC 37℃温箱孵育30 min。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。光学显微镜下观察并照相。采用双盲法观察RAD21免疫组化染色结果：以细胞核、细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.2.4生存分析：从公共基因芯片数据库Gene Expression Omnibus（GEO）中寻找并下载肺癌基因芯片数据，将肺癌患者按照RAD21的表达水平进行排序，进而分为高表达与低表达组，再应用Graphpad Prism5软件进行Kaplan-Meier分析，绘制生存函数曲线，用log-rank检验法进行差异显著性检验。

1.2.5基因集富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）：肺癌样本数据集 GSE10245被纳入GSEA。采用GSEA 2.0.14版软件进行分析。根据RAD21的表达水平将肿瘤组织样本分为高表达和低表达2组，之后通过GSEA法分析RAD21的表达水平对各种生物功能基因集的影响。首先，从GSEA网站MsigDB数据库中获得与生物信号转导相关的基因集作为参照基因集；然后，按缺省加权富集统计的方法进行富集分析，设置随机组合次数为1 000次。

2　结果

2.1肺癌组织中RAD21蛋白的表达情况

Western blot检测结果显示：与癌旁组织相比，RAD21在肺癌组织中的蛋白表达水平明显增高（图1）。免疫组织化学结果显示：RAD21阳性染色主要分布于细胞核以及细胞质，表现为大小不一的棕黄色颗粒（图2），癌旁组织中RAD21的染色较弱（图2A），相反，肺癌组织中RAD21染色较强（图2B）。提示肺癌中RAD21的表达水平增高，RAD21可能在肺癌中发挥癌基因的作用。

图1　Western blot方法检测肺癌及癌旁组织中RAD21的蛋白表达水平Fig.1　The protein level of RAD21 in the peritumor lung tissues and lung cancer tissues detected by Western blot

2.2肿瘤数据库肺癌基因芯片中RAD21基因的表达情况

在Oncomine公共数据库中查询RAD21基因在肺癌及癌旁组织中的表达情况，结果显示：RAD21基因在肺癌组织中呈高表达（P＜0.001）（图3），进一步支持了本实验结果。

2.3RAD21基因表达水平与肺癌患者预后呈负相关

分析GEO数据库基因芯片数据中RAD21的表达与肺癌患者生存时间的关系，绘制Kaplan-Meier生存曲线（图4），结果显示：RAD21的表达水平对患者的总生存时间有显著影响，与高表达组相比，RAD21低表达组肿瘤患者存活时间、无病生存时间以及复发时间均较长（图4）。

图2　免疫组织化学方法检测肺癌及癌旁组织中RAD21的表达情况×200Fig.2　The expression of RAD21 in the peritumor lung tissues and lung cancer tissues detected by immunohistom chem ical staining ×200

图3　 RAD21 m RNA在肺癌芯片数据库中的表达水平Fig.3　The exp ression levels of RAD21m RNA in lung cancer datasets

2.4 RAD21基因与细胞周期基因集密切相关

用GSEA方法分析肺癌样本数据集GSE10245 中RAD21的表达对各种生物学功能基因集的影响，结果显示：RAD21高表达的肿瘤样本富集了与细胞周期调控和细胞凋亡相关的基因集（图5）。说明RAD21可能通过影响肿瘤细胞增殖和凋亡能力促进肺癌的发展。

3　讨论

研究［10～12］表明，RAD21作为粘连复合体成员之一，参与了细胞的多种生理过程。最近的研究［5～9］表明，RAD21与肿瘤发生发展关系密切。本研究结果显示肺癌组织中RAD21的表达水平增高，并与患者的临床预后密切相关。本研究还用生物信息学方法推测了RAD21在肺癌中的作用，提示RAD21基因可能作为新的癌基因在肺癌中发挥重要作用。

本研究用免疫印迹法和免疫组织化学分析证实了肺癌中RAD21蛋白表达水平明显增高，同时，肺癌的多个微阵列数据也得到相似的结果。RAD21基因位于染色体8q24，该染色体区域在小细胞肺癌中存在扩增，其中一些癌基因（如C-MYC［13］）已经被确定。因此，RAD21在肺癌中异常表达的临床意义以及生物学功能值得深入探讨。

对基因芯片的分析结果表明，RAD21高表达的肺癌患者预后较差，这与乳腺癌或KRAS突变的结直肠癌研究［6，8］结果类似，在这些肿瘤中，RAD21的高水平表达预示不良预后。因此，RAD21可能作为肺癌预后判断的分子标志物。

本研究通过GSEA方法［14］对肺癌基因芯片进行分析，结果发现，肺癌中RAD21与调控细胞周期相关基因集和细胞凋亡相关基因集密切相关。有研究［15］表明，RAD21基因在乳腺癌中过表达，当沉默RAD21时，可以引起明显的细胞周期阻滞以及细胞凋亡，从而影响细胞活性。在染色质聚集、核碎裂前的细胞凋亡早期，RAD21蛋白可被剪切成分子量为64 000的小片段，发挥正反馈效应，扩大细胞死亡信号，介导细胞凋亡［12］。大量研究［3，4］已证实，RAD21作为保持姐妹染色单体结合并、确保正确复制的关键因素，参与了DNA双链断裂修复及减数分裂重组等过程，这些都是与细胞周期密切相关的关键环节。因此，尽管本研究组的初期实验未深入研究RAD21对肺癌恶性生物学行为的影响，但是生物信息学的分析结果提示，RAD21可能通过影响以上环节参与肺癌的恶性演进过程。

图4　 RAD21表达水平与肺癌患者预后的关系。Fig.4　The relationship between RAD21 expression level and the p rognosis of patients with lung cancer

图5　肺癌中RAD21的GSEA分析Fig.5　GSEA analysis of RAD21 in lung cancer

综上所述，本研究证实了RAD21在肺癌中的异常表达情况及其在临床预后判断中应用的可能性，并预测了其在肺癌中可能的生物学功能，为后续深入探究其在肺癌的恶性演进过程所起到的作用及机制奠定了良好的基础。

［1］Phipps J，Nasim A，Miller DR.Recovery，repair，and mutagenesis in Schizosaccharomyces pombe［J］.Adv Genet，1985，23：1-72.

［2］Hirano T.Chromosome cohesion，condensation，and separation［J］. Annu Rev Biochem，2000，69：115-144.

［3］Nasmyth K，Peters JM，Uhlmann F.Sp litting the chromosome：cutting the ties that bind sister chromatids［J］.Science，2000，288 （5470）：1379-1385.

［4］Biggins S，Murray AW.Sister chromatid cohesion in mitosis，current opinion in genetics and development［J］.Curr Opin Genet Dev，1999，9（2）：230-236.

［5］Xu H，Yan Y，Deb S，et al.Cohesin Rad21 mediates loss of heterozygosity and is upregulated via Wnt promoting transcriptional dysregulation in gastrointestinal tumors［J］.Cell Rep，2014，9（5）：1781-1797.

［6］Deb S，Xu H，Tuynman J，et al.RAD21 cohesin overexpression is a prognostic and predictive marker exacerbating poor prognosis in KRAS mutant colorectal carcinomas［J］.Br J Cancer，2014，110 （6）：1606-1613.

［7］Supernat A，Lapinska-Szumczyk S，Sawicki S，et al.Deregulation of RAD21 and RUNX1 expression in endometrial cancer［J］.Oncol Lett，2012，4（4）：727-732.

［8］Yan M，Xu H，Waddell N，et al.Enhanced RAD21 cohesin expression confers poor prognosis in BRCA2 and BRCAX，but not BRCA1 familial breast cancers［J］.Breast Cancer Res，2012，14（2）：R69.

［9］Xu H，Yan M，Patra J，et al.Enhanced RAD21 cohesin expression confers poor prognosis and resistance to chemotherapy in high grade luminal，basal and HER2 breast cancers［J］.Breast Cancer Res，2011，3（1）：R9.

［10］Li DJ，VermaD，Mosbruger T，et al.CTCF and Rad21 act as host cell restriction factors for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus （KSHV）lytic replication by modulating viral gene transcription ［J］.PLoS Pathog，2014，10（1）：e1003880.

［11］Urban E，Nagarkar-Jaiswal S，Lehner CF，et al.The cohesin subunit Rad21 is required for synaptonemal complex maintenance，but not sister chromatid cohesion，during Drosophila female meiosis［J］.PLoS Genet，2014，10（8）：e1004540.

［12］Pati D，Zhang N，Plon SE.Linking sister chromatid cohesion and apoptosis：role of Rad21［J］.Mol Cell Biol，2002，22（23）：8267-8277.

［13］Yamada T，Kohno T，Navarro JM，et al.Frequent chromosome 8q gains in human small cell lung carcinoma detected by arbitrarily primed-PCR genomic fingerprinting［J］.Cancer Genet Cytogenet，2000，120（1）：11-17.

［14］Subramanian A，Tamayo P，Mootha VK，et al.Gene set enrichment analysis：a knowledge-based approach for interpreting genomewide expression profiles［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102 （43）：15545-15550.

［15］Mahmood SF，Gruel N，Chapeaublanc E，et al.A siRNA screen identifies RAD21，EIF3H，CHRAC1 and TANC2 as driver genes within the 8q23，8q24.3 and 17q23 amplicons in breast cancer with effects on cell growth，survival and transformation［J］.Carcinogenesis，2014，35（3）：670-682.

（编辑王又冬）

ClinicalSignificanceand FunctionalPrediction ofUp-regulated RAD21 in Lung Cancer

GUXue-jing1，WUYue-ming2，GAOJing3
（1.DepartmentofHuman Anatomy，LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China；2.DepartmentofOncology，TheThird Affiliated Hospitalof LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121000，China；3.DepartmentofUltrasound，TheFirstAffiliated Hospitalof LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo detect the expression levels of RAD21（S.Pombe RAD21 homolog）in lung cancer，and assess its clinical significance and potential functions.Methods Theexpression levelofRAD21 in lung cancerwasdetermined byWestern blotand immunohistochemistrymethods；the RAD21mRNA expression in lung cancer was analyzed through Oncomine database；the relationship between the RAD21 expression levels and prognosis in patients with lung cancer was studied by Kaplan Meier curve；the RAD21 functions in lung cancer were predicted by using gene set enrichment analysis.Results Compared with adjacent normal tissue，the protein level of RAD21 in lung tissues were upregulated.The data from Oncomine database showed that RAD21mRNA levels were significantly higher than the normal control groups in multiple lung cancer datasets（P＜0.01）；inaddition，Kaplan-Meiersurvivalcurvesshowed thattheRAD21expression levelswascorrelatedwith thesurvivalofpatientswith lungcancer（P＜0.05）；gene set enrichment analysis indicated that RAD21 was mainly enriched in apoptotic signaling pathways and cell cycle regulation gene sets.ConclusionThe downregulated RAD21 could be used as a biomarker to assess the prognosis of lung cancer patients.In addition，RAD21maybe involved in theregulationofcellcycleandapoptosis，whichaffectsthedevelopmentand progressionoflungcancer.

lung cancer；RAD21；prognosis；immunohistochemistry

R34

A

0258-4646（2016）04-0328-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.010

辽宁省自然科学基金（2015020366）；辽宁省博士科研启动基金（201501102）

谷学静（1961-），女，高级实验师，本科.

高静，E-mail：chenjingnan88@163.com

2015-10-16

网络出版时间：

网络出版地址