降压类中成药及保健食品中21种非法添加化学药物的快速检测与确证方法研究

陈　林，温家欣，齐春艳，雷　毅，张　荣*

(1.广东药科大学　药科学院，广东　广州　510006;2.广东省药品检验所，广东　广州　510180;3.广东省食品检验所，广东　广州　510165)



降压类中成药及保健食品中21种非法添加化学药物的快速检测与确证方法研究

陈林1，温家欣2，齐春艳1，雷毅3*，张荣1*

(1.广东药科大学药科学院，广东广州510006;2.广东省药品检验所，广东广州510180;3.广东省食品检验所，广东广州510165)

采用亚3 μm色谱柱建立了降压类中成药及保健食品中21种非法添加化学药物的高效液相色谱快速检测及液相色谱-质谱联用确证方法。样品经甲醇-乙腈(体积比5∶5)超声提取，采用Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)色谱柱，以甲醇-乙腈(体积比2∶1)-甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)为流动相，梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量，液质联用法进一步定性确证。结果表明，21种成分在17 min内完成分离，方法检出限为0.03～0.50 mg/g，定量下限为0.09～1.50 mg/g，平均回收率为82.0%～109.0%。采用上述方法对107批从互联网收集的样品进行检测，阳性检出率为42.1%。该方法快速、准确，适用于降压类中成药及保健食品中非法添加药物的快速检测。

降压类中成药及保健食品；非法添加；高效液相色谱；液相色谱-质谱联用

高血压是一种高发性心血管疾病，同时也是导致慢性肾病、冠心病、脑中风等疾病的危险因素之一。降压类西药虽然疗效显著，但服用不当易产生毒副作用，需在临床医生指导下慎用。中药文化在我国历史悠久，以中草药为原料研制成的各种中成药、保健食品倍受患者青睐。然而不法分子为迎合消费者立竿见影的心态，在降压类保健食品及中成药中违法添加西药，患者服用这些产品后可能会使血压骤然下降或发生较大波动，甚至加重肾损害、诱发中风等疾病。

目前针对降压类中成药及保健食品中非法添加药物检测的国家标准(药品补充检验方法2009032及2014008)涉及12种成分(硝苯地平、阿替洛尔、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平)，文献[1-6]还报道了其他多种非法添加成分(如氨苯蝶啶[3]、氯沙坦[5]、比索洛尔[6]等)。面对数量庞大的降压类健康产品监督对象，迫切需要开发一套高通量分析方法。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术是多数文献报道的高通量分析方法[4-6]，但由于仪器昂贵、维护成本高，使得方法普及受限。随着液相色谱柱填料技术的迅速发展，人们根据色谱速率理论，通过减小填料粒径来提高柱效及克服小粒径色谱柱的高柱压，制成粒径小于3 μm的亚3 μm色谱柱[7-9],既满足了高通量分析需求,同时又凭借较低的柱压广泛应用于常规HPLC系统，实现了多成分的同时快速分析。因此基于亚3 μm色谱柱建立高效液相色谱快速检测方法并配合液质联用确证技术，对提高检测效率和监管效能具有重要的实用意义。本文采用亚3 μm色谱柱，选择补充检验方法2009032和2014008分析的12种成分及其他9种可能添加的成分作为研究对象，建立了降压类中成药及保健食品中21种非法添加化学药物的HPLC快速检测及LC-MS/MS定性确证方法。

1　实验部分

1.1仪器与材料

Waters 2690型高液相色谱仪，2998二极管阵列检测器(美国Waters公司)；API 5500液质联用仪(美国AB公司)；Millipore Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)；PB-10 pH计(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Startorious CP225D十万分之一天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)等。

对照品：阿替洛尔、卡托普利、氢氯噻嗪、盐酸普萘洛尔、氨苯蝶啶、硝苯地平、苯磺酸左旋氨氯地平、利血平、氯沙坦钾、替米沙坦、尼莫地平、尼群地平、坎地沙坦酯、缬沙坦(中国食品药品检定研究院)，盐酸可乐定、甲磺酸多沙唑嗪、吲达帕胺、尼索地平、盐酸哌唑嗪、富马酸比索洛尔、非洛地平(中国药品生物制品检定所)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯)，实验用水为超纯水。

1.2溶液制备

1.2.1对照品溶液精密称取上述21种对照品各10 mg至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈(5∶5,体积比)配制成浓度为1.0 mg/mL的储备液，置于2～4 ℃避光冷藏备用。临用时，取上述储备液用初始比例流动相稀释配成不同浓度的标准工作液。

1.2.2供试品溶液固体样品(丸剂与片剂研细，胶囊剂取内容物)：准确称取0.3 g样品置于50 mL离心管中，加入40 mL甲醇-乙腈(5∶5)，超声提取15 min，冷却至室温，5 000 r/min离心5 min，取上清液转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀；液体样品：精密量取10 mL样品置于50 mL离心管中，加入30 mL甲醇-乙腈(5∶5)，超声提取15 min，冷却至室温，将溶液转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。取提取液2 mL至10 mL容量瓶中，用流动相B(甲酸水溶液)稀释并定容至刻度，过0.45 μm尼龙滤膜，滤液供HPLC检测。阳性样品溶液根据HPLC检测结果，用流动相B适当稀释，制成目标物浓度约为1 μg/mL的样品溶液，过0.22 μm尼龙滤膜，滤液供LC-MS/MS检测。

1.3HPLC条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为甲醇-乙腈(2∶1)，B为甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)，流速：0.8 mL/min；梯度洗脱程序：0～4 min，15%～54%A；4～8 min，54%～58%A；8～10 min，58%～90%A；10～12 min，90%A；12～13 min，90%～15% A；13～17 min，15%A。检测波长：215，270，350 nm。

HPLC法中，采用与对照品的色谱保留时间和紫外吸收光谱图比较的方式进行定性分析；取系列标准溶液分别进样，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归建立标准曲线，外标法进行定量分析。阳性样品进一步用LC-MS/MS法定性确证。

1.4LC-MS/MS条件

1.4.1液相色谱条件色谱柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为甲醇-乙腈(2∶1)，B为甲酸水溶液(pH 2.5±0.1)，流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～4 min，10%～55%A；4～6 min，55%～65%A；6～8 min，65%～75%A；8～10 min，75%～90%A；10～12 min，90%A；12～13 min，90%～10% A；13～17 min，10%A。

1.4.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正负离子检测方式，采用选择离子全扫描二级质谱模式；温度：550 ℃；气帘气压力：40 psi；碰撞气压力：9 psi；离子喷射电压：5 500 V(正离子模式)，-4 500 V(负离子模式)。其他质谱分析参数见表1。

表1　21种降压药物的质谱分析参数Table 1　MS/MS parameters of 21 antihypertensive drugs

2　结果与讨论

2.1色谱柱的选择

由于待分析的21种化合物极性差异大，文献及补充检验方法采用的常规5 μm色谱柱难以在短时间内对多种成分同时快速分离，亚3 μm色谱柱由于采用实心硅核而减小了颗粒内部扩散路径，可明显改善色谱峰形及分离度，实现多成分快速分析。实验分别考察了Agilent Poroshell 120 EC C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，Agilent Poroshell 120 SB C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，Kinetex C18(100 mm×4.6 mm，2.8 μm)和Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)不同键合相色谱柱的分离效果。结果显示，由于卡托普利的末端吸收严重，其色谱峰形与信号响应较其他20种药物差，其中，SB C18色谱柱对卡托普利的分析效果相对最好，但替米沙坦、利血平、硝苯地平的分离效果不佳。而Phenyl-Hexyl对21种化合物的分离效果最优，因此选择Phenyl-Hexyl色谱柱进行分离。

2.2流动相的选择

对于降压类药物非法添加检测，国家标准及多数文献[2-6]选择“磷酸水溶液-乙腈”作为HPLC法流动相、“甲酸水溶液-甲醇”作为LC-MS/MS 法流动相。若HPLC法与LC-MS/MS法的流动相体系不同，则方法转移时需重新开发液相色谱方法。文献[10-11]以甲醇-乙腈(2∶1)-0.02 mol/L乙酸铵作为HPLC法及LC-MS/MS法流动相，经实验发现，该流动相体系的分析效果优异，但阿替洛尔保留较弱，卡托普利的色谱峰信号响应较差。将乙酸铵换成甲酸水溶液后，卡托普利的色谱峰响应得到显著改善。研究还发现，阿替洛尔的保留时间以及硝苯地平、利血平和替米沙坦3个成分之间的分离度受流动相pH值的影响较大。分别考察了甲酸水溶液pH值为2.0～5.0时对21种降压药物的分析效果，结果显示，pH(2.5±0.1)时，各成分均能实现较好的分离，且阿替洛尔的保留时间与卡托普利的色谱峰信号响应均满足分析要求。

2.3波长的选择

卡托普利与可乐定主要在215 nm附近有吸收；吲达帕胺、氢氯噻嗪、利血平、洛尔类(阿替洛尔、比索洛尔、普萘洛尔)及沙坦类(氯沙坦、替米沙坦、缬沙坦)成分在270 nm均有吸收；氨苯蝶啶及地平类(氨氯地平、硝苯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平)成分在350 nm附近吸收较强。因此根据各成分的紫外光谱吸收特征，卡托普利和可乐定选择215 nm，吲达帕胺、氢氯噻嗪、利血平、洛尔类及沙坦类成分选择270 nm，氨苯蝶啶及地平类成分选择350 nm作为检测波长。

2.4柱温的选择

以卡托普利为例，考察了柱温对色谱峰的影响，文献发现随着柱温升高，卡托普利的柱效增加，当柱温升至60 ℃时，其柱效不再随柱温升高而增加[12]。且柱温过高易造成色谱柱寿命降低。经试验，当温度达40 ℃时，卡托普利的色谱峰响应和理论塔板数均能满足分析要求，因此选择柱温为40 ℃。

2.5效能分析

按“1.3”色谱条件进样，21种成分在17 min内可完全分离，液相色谱图见图1。选择分析性能优异的ACE色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)作为传统5 μm色谱柱代表，进样分析。对比分析发现，21种成分在传统5 μm色谱柱上也能获得良好分离，但分析时间需45 min，而采用亚3 μm色谱柱可节省约62%分析时间和约70%的溶剂。

2.6线性关系、定量下限及检出限

取系列浓度待测物标准溶液，按“1.3”液相色谱条件进样检测，以峰面积(y)对进样浓度(x，μg/mL)进行回归计算，线性回归方程及相关系数(r2)见表2。卡托普利在5.0～100.0 μg/mL，其他20种药物在1.0～100.0 μg/mL范围内线性良好，r2不低于0.999 0。

取阴性样品提取液2 mL置于10 mL容量瓶中，加入21种药物混合对照品溶液适量，用初始比例流动相逐级稀释，以3倍信噪比计算检出限(LOD)，10倍信噪比计算定量下限(LOQ)，结果见表2。21种药物的LOD为0.03～0.50 mg/g，LOQ为0.09～1.50 mg/g。

表2　21种化学药物的线性方程、相关系数(r2)、LODs、LOQs、回收率及精密度Table 2　Linear equations,correlation coefficients(r2),LODs,LOQs，average recoveries and RSDs for 21 kind of chemical drugs

(续表2)

a:spiked 5 mg·g-1；b:spiked 10 mg·g-1；c:spiked 20 mg·g-1;peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.7回收率、精密度与稳定性

选择阳性检出率较高的胶囊制剂作为回收率试验基质，精密称取胶囊内容物0.3 g，置于50 mL容量瓶中，加入混合对照品适量，配制3个质量浓度，每个浓度水平配制6份，按“1.2.1”方法进行样品处理后，进样检测。结果显示，21种成分的回收率为82.0%～109.0%，相对标准偏差(RSD)为0.1%～3.6%(表2)。

取20 μg/mL混合对照品溶液，分别于0,4,8,12,18,24 h进样，各成分峰面积的RSD为0.5%～1.8%，表明21种成分供试品溶液至少在24 h内稳定。

表3　12种检出成分的检测结果Table 3　Results of 12 kinds of detected components

2.8实际样品的测定

从互联网收集107批次样品，按上述方法检测，共发现阿替洛尔、氢氯噻嗪、卡托普利等10种成分，阳性检出率为42.1%，检出含量见表3。其中缬沙坦为国内首次报道；氢氯噻嗪、硝苯地平、尼群地平、氨氯地平是最常见的4种非法添加化学药物。样品中存在多种成分混合添加的情况，其中以“氢氯噻嗪+地平类”最为常见。虽然阳性成分的检出含量均在单一用药安全起效剂量范围内，但同时摄入两种以上降压药可能使血压骤然下降或产生药物相互作用引发其他严重的不良反应。

本研究还在部分样品中检出阿司匹林、西地那非及其水解产物水杨酸。阿司匹林可联合降压药物用于治疗高血压[13-14]，西地那非用于治疗肺动脉高压[15-16]。但西地那非具有壮阳作用，阿司匹林易诱发或加重胃溃疡，这些通过联合用药增强降压作用的非法添加行为给患者带来严重的安全风险。

上述结果表明，从互联网购买的降压类健康产品非法添加化学药物情况比较严重，需加强监管。

2.9LC-MS/MS法定性确证结果

对于选择离子全扫描二级质谱，由于受目标成分浓度和基质影响，很难采用全谱进行定性评价，因此在相同分析条件下，一般采用与标准物质溶液比较是否具有特征碎片离子峰的方法进行定性评价。图2A为代表性阳性成分缬沙坦标准溶液的二级质谱图，图2B和C为经HPLC法检测含非法添加药物的代表性基质胶囊阳性样品的总离子流图与二级质谱图。由图2C可见样品二级质谱图中的选择分子离子峰m/z436.3及碎片离子峰m/z306.4，290.9，235.2，207.0，与图2A中缬沙坦对照品均一致，可确证该非法添加药物为缬沙坦。

3　结　论

本文采用亚3 μm色谱柱建立了降压类中成药及保健食品中21种非法添加化学药物的液相色谱高通量快速分析及LC-MS/MS定性确证方法，在降压类保健食品中首次发现了新非法添加成分缬沙坦及其他可能用于辅助降血压的药物西地那非、阿司匹林。研究结果表明该方法专属性强、灵敏度高、适用性广，与传统5 μm色谱柱相比，提高了检验效率，减低了检验成本，同时减少了废液排放，对环境保护具有重要意义。

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Rapid Detection and Conformation of 21 Illegal Chemical Drugs in Antihyertension Traditional Chinese Medicine and Healthy Food

CHEN Lin1,WEN Jia-xin2,QI Chun-yan1,LEI Yi3*,ZHANG Rong1*

(1.School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou510006，China;2.Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou510180，China;3.Guangdong Institute of Food Inspection，Guangzhou510165，China)

A method was developed for the determination and conformation of 21 illegal chemical drugs in antihypertension traditional Chinese medicines and health care foods by HPLC-DAD and LC-MS/MS with sub-3 μm particle column.The samples were extracted with methanol-acetonitrile(5∶5,by volume),then separated on an Agilent Poroshell 120 phenyl-Hexyl(100 mm×4.6 mm,2.7 μm) by gradient elution with methanol-acetonitrile(2∶1,by volume)- formic acid water solution(pH 2.5±0.1) as mobile phase,detected with DAD in wavelength range of 200-400 nm.Quantification analysis were performed by the external standard method.The positive samples were further identified and verified by LC-MS/MS.The results indicated that 21 analytes were separated completely in 17 min.The detection limits of 21 target compounds ranged from 0.03 mg/g to 0.50 mg/g.The average recoveries at three spiked levels ranged from 82.0% to 109.0%.The method was applied in the analysis of 107 batches of samples from online shopping,among which 45 batches were added with the chemicals with a positive rate of 42.1%.The method was accurate,rapid and sensitive,and was suitable for the determination of illegally added chemical drugs in traditional Chinese medicine and healthy food of antihypertension.

traditional Chinese medicine and healthy food of antihypertension;illegal;HPLC;LC-MS/MS

2016-01-26；

2016-02-17

广东省省级科技计划项目(2013B090200059)；广州市健康产品非法添加化学成分快速检测技术重点实验室项目(2013) ；广东省食品药品检验检测技术创新专项资金项目(2015ZX01)

雷毅，博士，主任药师，研究方向：食品药品检验，Tel：020-66808380，E-mail：Leiy04@qq.com

张荣，博士，教授，研究方向：物理药学,E-mail：zhangr-zju@hotmail.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.002

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)08-0937-06