沉淀聚合法制备3-吲哚乙酸印迹聚合物微粒及其固相萃取应用

张铁莉,赫彩霞，王　磊

(1.唐山师范学院　化学系，河北　唐山　063000；2.河北科技大学　生物科学与工程学院,河北　石家庄　050018)



沉淀聚合法制备3-吲哚乙酸印迹聚合物微粒及其固相萃取应用

张铁莉1*,赫彩霞1,2，王磊1

(1.唐山师范学院化学系，河北唐山063000；2.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄050018)

以3-吲哚乙酸(IAA)为模板分子、丙烯酰胺(AA)为功能单体，采用沉淀聚合法制备了IAA印迹聚合物微粒，研究了致孔剂乙腈的用量及IAA的加入量对印迹聚合物结合性能的影响，采用色谱法对其进行评价。结果表明，当乙腈为37.5 mL，IAA为2 mmol(与AA物质的量比为1∶1)时，制得印迹聚合物P7对IAA的亲和力最大(k=4.24)，印迹因子(IF)为14.1，其对IAA展示了最显著的特异识别能力。将P7作为固相萃取柱的填料，研究了分子印迹固相萃取IAA的方法，测得绿豆芽样品的加标回收率为90.6%～92.6%。结果表明，以AA为功能单体沉淀聚合法制备的IAA印迹聚合物颗粒适合作为固相萃取柱填料，可实现实际样品中IAA的选择性分离净化。该文提出的采用适当增大模板分子加入量的方法是制备高亲和力与高选择性印迹聚合物的一条新途径。

3-吲哚乙酸;沉淀聚合;分子印迹聚合物;固相萃取;高效液相色谱(HPLC);绿豆芽

沉淀聚合属于非均相溶液聚合，可直接制得聚合物微粒，避免了传统本体聚合制得棒状或块状聚合物需要研磨、过筛等繁琐操作，具有操作简便的优点，因此在分子印迹聚合物的制备中得到了日益广泛的研究和应用[1-5]。沉淀聚合印迹聚合物的性能受许多因素的影响[6]，目前研究最多的是致孔剂和功能单体的影响[1-4]。分子印迹聚合物对模板分子具有预定的选择性，特别适宜作为固相萃取的填料，开发基于分子印迹固相萃取(MISPE)的样品前处理方法，以用于环境、食品、天然产物等复杂样品的分析测定[7-9]。3-吲哚乙酸(IAA)是一种植物激素，对植物的生长发育具有重要的调控作用，但植物内源IAA的含量甚微，测定时通常需对样品进行分离富集等前处理，因此研制对IAA具有高选择性的印迹识别材料已引起广泛关注[10-15]。采用沉淀聚合法直接制备IAA印迹聚合物微粒并用于固相萃取尚未见文献报道。

为了得到高亲和力与高选择性且适宜MISPE的IAA印迹聚合物，本文在已有研究工作[15]的基础上，以AA为功能单体，系统考察了沉淀聚合法中模板分子及致孔剂的用量对所制备IAA印迹聚合物结合性能的影响，将优化的印迹聚合物作为MISPE的柱填料，建立了MISPE萃取IAA的方法，并成功用于实际样品的分离净化。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

LC 2000高效液相色谱仪(上海天美科学仪器有限公司)；S-4800-1场发射扫描电镜(日本Hitachi公司)；TENSOR37 傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)；CT15RT台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SYC-15C超级恒温水浴(郑州南北仪器设备有限公司)；KQ-400 KDE 高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent12管真空固相萃取仪(美国Agilent公司)；AP-01P无油真空/压力泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。3-吲哚乙酸(IAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均购于北京百灵威科技有限公司；3-吲哚甲酸(ICA)、3-吲哚丙酸(IPA)、3-吲哚丁酸(IBA)、对氨基苯甲酸(ABA)、烟酸(NA)、丙烯酰胺(AA)均购于北京化学试剂公司；偶氮二异丁腈(AIBN，国药集团化学试剂有限公司)使用前以甲醇重结晶；冰乙酸(天津市天大化学试剂厂)。除特殊注明外，以上试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

1.2聚合物的制备

按照表1，将2 mmol(142.0 mg) AA和一定量的IAA溶于一定体积的乙腈中，超声30 min，于4 ℃冰箱放置过夜，加入10 mmol(1.89 mL)EGDMA和44.0 mg AIBN，混匀，通N210 min，密封后于60 ℃水浴反应24 h。聚合物用甲醇-醋酸(9∶1)超声分散并洗脱除去IAA，再用甲醇洗去聚合物中残留的乙酸，60 ℃真空干燥得到印迹聚合物(P)。除制备时不加IAA外，相应空白聚合物(BP)的制备和处理步骤同上。

表1　预聚合反应液的组成Table 1　Compositions of the prepolymerization mixtures for preparation of IAA-imprinted polymers

1.3色谱法评价印迹聚合物的分子识别性能

将聚合物装填于150 mm×4.6 mm色谱柱中，以乙腈为流动相，流速为1.0 mL/min，测定IAA及其类似物的保留时间tR，以丙酮测量死时间t0，组分浓度为0.1 mmol/L，进样量为20 μL，紫外监测波长固定为各组分的最大吸收波长，按公式k=(tR-t0)/t0计算保留因子k，根据α=kt/ki计算分离因子α，其中kt和ki分别为IAA和各类似物的k。采用印迹因子IF和选择性因子f评价印迹效率[14]，其中，IF=kP/kBP；f=αP/αBP。

1.4扫描电镜的测定

将聚合物P7和BP2样品粉末均匀粘在导电胶上，喷金制样后，测定其扫描电镜图像。

1.5绿豆芽样品的提取

绿豆芽样品购自本地菜市场，称取5.00 g捣碎的绿豆芽样品，加入20 mL冷甲醇，超声提取30 min，于4 ℃冰箱放置过夜，离心，保存上清液，残渣再用10 mL冷甲醇超声提取1 h，重复提取1次，合并3次上清液，得到绿豆芽样品的甲醇提取液，于40 ℃水浴中旋蒸至干，用10 mL乙腈溶解并过0.45 μm尼龙滤膜，得到样品液，于4 ℃冰箱保存，作为绿豆芽样品MISPE的上样液备用。

1.6固相萃取

1.6.1固相萃取柱的制备称取200.0 mg聚合物P7，于甲醇中超声分散，匀浆全部转移至6 mL聚丙烯固相萃取空柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司)，置于固相萃取装置中，对MISPE小柱反复真空抽压，确保聚合物紧密压实，得到实验用MISPE柱(两端用配套的筛板封堵)。按照同法制备BP2为填料的非印迹聚合物固相萃取(NISPE)小柱。

1.6.2固相萃取操作MISPE或NISPE柱依次用5 mL甲醇和5 mL乙腈活化后，加入1.0 mL样品液，待其自然流出后，加入2×1.0 mL乙腈淋洗，再用2×1.0 mL甲醇洗脱，收集洗脱液并浓缩至1.0 mL，过0.45 μm尼龙滤膜，供HPLC检测。

1.7HPLC条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm)；流动相：水(含0.01%甲酸)-甲醇(60∶40)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：279 nm。

2　结果与讨论

2.1聚合条件对印迹聚合物分子识别性能的影响

非共价分子印迹中，致孔剂会影响模板分子与功能单体形成复合物的结合强度及聚合物的形貌，进而影响印迹聚合物的结合性能。沉淀聚合分子印迹中，常用致孔剂有乙腈、甲醇、甲苯等单一溶剂或其二元混合溶剂[2,16-18]。此外，模板分子加入量对聚合物的结合性能亦有影响，但系统研究不多[16,19]。传统的研究思路多是在保持功能单体大量过量的条件下，改变模板分子的加入量制备聚合物[20-22]，而在模板分子相对大量的情况下，通过适当提高模板分子相对于功能单体的比例(1∶4～1∶10[21])来制备对模板分子具有高亲和力的印迹聚合物的研究鲜见报道。为此，本文以IAA为模板分子，乙腈为致孔剂，采用沉淀聚合法制备了乙腈及IAA不同加入量条件下的一系列印迹聚合物，并以IAA及其类似物为结合底物，采用HPLC法对印迹聚合物的吸附性能进行评价，优化了IAA印迹聚合物的制备条件。

2.1.1致孔剂乙腈加入量的影响在3种乙腈加入量条件下(表1)，制备了印迹聚合物P1，P2，P3及对应的空白聚合物BP1，BP2，BP3，HPLC法分别测得其在乙腈流动相中对IAA的保留因子k。P1，P2和P3对IAA的k值分别为1.02，1.65和1.58，即IAA在P2上的k值最大，而IAA在BP1，BP2和BP3上的k值分别为 0.23，0.30和0.29，其k值相近，且明显小于在印迹聚合物上的k值。表明P2对IAA具有最大的亲和力与印迹效应。因此，后续研究选择乙腈的加入量为37.5 mL。

2.1.2模板分子IAA加入量的影响功能单体与模板分子的比例对印迹聚合物的印迹效应会产生影响。该比例过大时，会导致功能单体的自聚，不利于特异识别位点的形成；比例过小时，则会因预聚合反应液中形成的模板分子-功能单体复合物的量不足而降低聚合物的特异结合能力[16,21]。为制备对IAA有高亲和力与选择性的印迹聚合物微粒，考察了模板分子IAA的加入量对印迹聚合物结合性能的影响。

固定功能单体AA的加入量为2 mmol，改变模板分子IAA的加入量，制备了6种印迹聚合物P2及P4～P8(表1)，其对应的空白聚合物为BP2。HPLC测得各聚合物在乙腈流动相中对IAA的k值(图1)。由图1可知，随着IAA加入量的增加，IAA的k值逐渐增大，P7时k值达到最大。IAA的加入量继续增大时，所得聚合物P8对IAA的k值降低。IAA加入量为2 mmol时，对应IAA∶AA为1∶1(物质的量比)，即当预聚合反应液中模板与功能单体的物质的量比(常用配比为1∶4[23])较大时，制得聚合物P7对IAA的亲和力最大。表2给出了P7对IAA及类似物的色谱保留数据。由表2可知，IAA的IF为14.1，且各类似物的f值较大，说明由于IAA的印迹效应，P7对IAA表现出显著的印迹亲和力及选择性。

研究结果表明，通过适当增大预聚合反应液中模板分子IAA的加入量，可显著提高印迹聚合物对IAA的选择性结合能力。其原因为：当AA的浓度固定不变时，随着IAA加入量的增大，预聚合反应液中模板-功能单体复合物的量增多，这有利于增加印迹聚合物中的识别位点数，因为交联共聚反应发生在AA和交联剂EGDMA之间，而预聚合反应液中二者的浓度保持不变，因此反应所得单位质量的印迹聚合物中形成的识别位点数目随之增多，从而使得印迹聚合物对IAA的亲和力与选择性提高。然而，与功能单体大量过量的情况相似[16,21]，当IAA加入量过大时，由于IAA分子自身发生缔合作用的机会亦随之增多，反而会减小其与功能单体形成复合物的机会，从而导致印迹聚合物对IAA的亲和力减弱。从化学平衡的角度考虑，对于廉价易得的模板化合物，制备其印迹聚合物时，可考虑适当增大模板分子的加入量，来提高印迹聚合物对目标化合物的特异亲和力。

表2　IAA及其类似物在P7 和 BP2上的色谱保留Table 2　Chromatographic retentions of IAA and its analogues on P7 and BP2

2.2聚合物的形貌特征

由图2可知，采用沉淀聚合法制备的P7与BP2的总体形貌相似，为微米级不规则的聚集态粒子。实验中发现，功能单体的性质对印迹聚合物的形态有很大影响[15]。当以4-乙烯基吡啶为功能单体时，制备的IAA印迹聚合物和空白聚合物均能很好地分散在聚合体系中(呈乳浊液)，聚合物颗粒较小，尽管其对IAA具有一定的分子识别能力，但因其易穿过萃取柱的筛板，不宜作为固相萃取柱填料；而以AA为功能单体制备的印迹聚合物和空白聚合物，均为疏松的蜂窝状，经超声很容易分散开，颗粒大小适合作为常用MISPE小柱的填料。

图2P7和BP2的扫描电镜图
Fig.2Scanning electron micrographs of P7and BP2

2.3分子印迹固相萃取

2.3.1HPLC法测定IAA与IBA的分析性能参数测定了一系列不同浓度(c，μmol/L) IAA和IBA标准溶液的色谱峰面积(A)，得到IAA和IBA的标准曲线方程分别为A=3 700.9c-576.0(r2=0.996 3)和A=5 114.4c-92.4(r2=0.997 4)；线性范围分别为0.5～20 μmol/L和1～20 μmol/L，检出限(S/N=3)分别为0.2 μmol/L和0.5 μmol/L。

2.3.2MISPE柱容量的测定选用印迹聚合物P7为柱填料，制备了MISPE小柱。为了保证目标物质的定量回收，目标物质的上样量必须小于MISPE柱的容量。采用固定上样体积，通过检测上样流出液中是否有IAA流出，测定了MISPE柱允许IAA的最大上样浓度。分别以浓度为5，10，15，20，25 μmol/L的IAA乙腈标准溶液为上样液，固定上样体积为1.00 mL，抽真空使上样液全部流出小柱，收集上样流出液，HPLC法检测。结果表明，当上样液中IAA浓度≤20 μmol/L时，流出液中均未检出IAA，而当IAA浓度为25 μmol/L时，可检出IAA。因此，本文操作模式下，上样液中IAA浓度为20 μmol/L时，MISPE柱对IAA达到最大吸附，计算得到其对IAA的最大动态吸附量即柱容量为3.50 μg/200 mg。2.3.3MISPE上样、淋洗和洗脱条件的确定及其选择性为了使印迹聚合物对模板分子保持最大的特异性结合作用，并减小其非特异性结合作用，本文的上样溶剂及淋洗剂均选用乙腈[20]，淋洗MISPE柱的方法为2×1.00 mL乙腈。甲醇及甲醇-醋酸常用作MISPE的洗脱剂[20,24]，分别考察了甲醇和甲醇-醋酸(90∶10)对IAA的洗脱效果。当选用甲醇洗脱时，每次加入甲醇1.00 mL，洗脱2次IAA可全部洗脱；而用1.00 mL甲醇-醋酸(90∶10)即可将IAA全部洗脱。为了方便后续操作，选择2×1.00 mL甲醇洗脱。

采用浓度均为10 μmol/L 的IAA-IBA乙腈混合液作为上样液，考察了MISPE小柱的选择性。分别收集其在MISPE 3个不同阶段的流出液并进行HPLC检测，测得在上样阶段二者均未流出柱子；在淋洗阶段，淋洗液中未检出IAA，但有61.3%IBA进入淋洗液中；在洗脱阶段，IAA的回收率为93.8%，而IBA的回收率为34.0%。由此可知，MISPE柱能够选择性萃取IAA，这与HPLC表征印迹聚合物的结果一致。

2.3.4绿豆芽样品的分离分析选择新鲜绿豆芽为测试样品，考察了MISPE 柱对实际样品中IAA分离净化的可行性。对绿豆芽样品液及3个不同加标水平的加标液，按“1.6.2”方法进行MISPE处理，图3为HPLC测得绿豆芽样品的色谱图。

图3绿豆芽样品液(A)、加标液(B)、加标液经MISPE洗脱液(C)的色谱图
Fig.3Chromatograms of mungbean sprout extract(A),spiked with 5 μmol/L IAA(B),and its eluents after MISPE(C)

由图3A可知，绿豆芽样品液的组成较复杂，保留时间为8.32 min的组分为IAA，加标液的色谱图(图3B)也证实该峰是样品中IAA产生的。由加标液经MISPE后的洗脱液的色谱图(图3C)可知，以P7为填料的MISPE 柱对IAA具有特异性结合，能够实现绿豆芽样品中IAA的分离净化。作为对比，加标液经NISPE柱后所得洗脱液的色谱图中，IAA及其共存组分的峰均大大降低或消失，这是由于组分在NISPE 柱上的保留为非特异性吸附，样品中的大部分组分在上样及冲洗阶段从柱中流出。

采用绿豆芽样品进行加标，经MISPE 柱处理后，考察该方法对IAA的加标回收率，测定结果列于表3。结果显示，IAA的加标回收率为90.6%～92.6%，相对标准偏差(RSD)均小于5%。因此，以P7为填料的MISPE 柱适于绿豆芽样品中IAA的分离净化。

表3　绿豆芽加标样品中IAA的回收率(n=3)Table 3　Recoveries of IAA in spiked mungbean sprout(n=3)

3　结　论

以IAA为模板分子，AA为功能单体，在IAA与AA物质的量比为1∶1，即模板分子加入量较传统配比量更大的条件下，采用沉淀聚合法制得对IAA具有高亲和力与选择性的分子印迹聚合物颗粒，将其用于绿豆芽样品的MISPE处理，可实现IAA的分离净化，为实际样品中IAA的分离测定提供了依据。此外，本文研究结果为高亲和力和选择性印迹聚合物的制备提供了一条新途径，即聚合反应时采用适当增大模板分子加入量的方法来提高印迹聚合物对目标化合物的特异亲和力。

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Preparation of Indole-3-acetic Acid-imprinted Polymer Particulates by Precipitation Polymerization and Their Application in Solid Phase Extraction

ZHANG Tie-li1*,HE Cai-xia1,2,WANG Lei1

(1.Department of Chemistry,Tangshan Normal College,Tangshan063000,China;2.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang050018,China)

Indole-3-acetic acid(IAA)-imprinted polymer microparticles were synthesized using IAA as template,acrylamide(AA) as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker in acetonitrile porogen via precipitation polymerization.Effects of amounts of IAA and acetonitrile utilized in the polymerization reaction on the binding performances of IAA-imprinted polymers were evaluated by high-performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the IAA-imprinted polymer P7with the highest affinity(k=4.24) and imprinting factor(IF=14.1) for IAA was obtained when the molar ratio of IAA to AA 1∶1 was adopted with 2 mmol of IAA in 37.5 mL of acetonitrile porogen.Furthermore,P7was chosen as the packing material to make the molecularly imprinted solid phase extraction(MISPE) column,and the MISPE method was developed for the purification of IAA .Under the optimized extraction conditions,the mungbean sprout samples spiked with IAA were extracted,and the recoveries of IAA ranged from 90.6%to 92.6%.The results demonstrated that the IAA-imprinted polymer particulates prepared using AA as the functional monomer by precipitation polymerization could be used as the adsorbent of solid phase extraction column for the selective separation and purification of IAA in real samples.A new route was proposed in this paper to synthesize an imprinted polymer with high affinity and high selectivity by means of increasing amount of template appropriately in the pre-polymerization mixture.

indole-3-acetic acid(IAA);precipitation polymerization;molecularly imprinted polymer;solid phase extraction;high performance liquid chromatography(HPLC);mungbean sprout

2015-12-25；

2016-02-15

唐山师范学院团队支撑重点项目(2014D07)

张铁莉，博士，教授，研究方向：分子印迹和分子发光，Tel：0315-3863197，E-mail:tielizhang@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.006

O657.72;O629.8

A

1004-4957(2016)08-0962-06