元素分析-碳同位素比值质谱法在纯正葡萄汁掺假鉴别中的应用

谭梦茹，费晓庆，吴　斌，沈崇钰，张　睿，丁　涛，刘　芸，杨功俊*

(1.中国药科大学　药学院，江苏　南京　211198;2.江苏出入境检验检疫局　食品实验室，江苏　南京　210001)



元素分析-碳同位素比值质谱法在纯正葡萄汁掺假鉴别中的应用

谭梦茹1，费晓庆2*，吴斌2，沈崇钰2，张睿2，丁涛2，刘芸2，杨功俊1*

(1.中国药科大学药学院，江苏南京211198;2.江苏出入境检验检疫局食品实验室，江苏南京210001)

采用元素分析-同位素比值质谱法(EA-IRMS)对纯正葡萄汁掺假情况进行研究。通过测定152个不同产区纯正葡萄汁的碳同位素比值(δ13C值)，初步建立了纯正葡萄汁的同位素数据库。检测结果表明，纯正葡萄汁中糖的δ13C值(δ13CS)范围为-26.92‰～-24.16‰，而有机酸的δ13C值(δ13CO)范围为-27.56‰～-24.99‰。根据上述两个参数，提出了纯正葡萄汁应满足的δ13C值要求：有机酸和糖的差值(Δδ13CO-S)在-1.63‰～0.72‰范围内。采用该法对85个市售葡萄汁进行检测，检出31个掺入碳-4植物糖和有机酸的阳性样品。糖浆添加实验的结果表明，该方法可以检测8%以上碳-4植物糖的掺假，能有效鉴别葡萄汁的掺假，在葡萄汁的品质保证方面有很大的实际应用潜力。

元素分析；同位素比值质谱；葡萄汁掺假；碳-4植物糖

葡萄含有很多活性物质，具有抗毒杀菌、抗氧化延缓衰老、抗动脉粥样硬化等功效[1-2]。由于葡萄的营养功效逐渐得到消费者的认可，葡萄汁销售额所占比例逐年加大[3]。与此同时，一些果汁生产企业受利益驱使对纯正葡萄汁进行非法添加，果汁中的常见添加物有糖、有机酸、色素和香精。国际食品法典委员会及国家标准关于果汁的规定指出，在果汁中添加任何成分均应在标签注明[4-5]。目前关于果汁掺假的鉴别方法主要有高效液相色谱-串联质谱法[6]、裂解质谱法[7]、电子鼻[8]、毛细管电泳法[9]、光谱法[10]、气相色谱-串联质谱法[11]等。但由于果汁中内源性物质和外源性添加物质在结构和化学性质上的相似性，上述方法仍不足以很好地鉴别果汁掺假。

近年来，稳定同位素技术已发展成为解决食品掺假及产地溯源问题的一个强有力手段。目前，通过该技术实现了对各种食品的掺假鉴定(蜂王浆、油脂、葡萄酒、调味品等)以及产地溯源(如果汁、乳制品和蔬菜等)[12-15]。通过碳-3和碳-4两种不同植物光合作用代谢途径所得产物δ13C值的差异，可以鉴别碳-3代谢的纯正葡萄汁中是否掺入碳-4代谢产物。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

Flash 2500型元素分析仪和DELTA V Advantage同位素质谱仪(美国Thermo Scientific公司)；FD115型恒温干燥箱(德国Bingder公司)；5 mm×3.5 mm锡杯(英国Element Microanalysis公司)；RJ-LDL-50G型低速大容量多管离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；WH-861型涡旋混合器(太仓市华利达实验设备有限公司)；JYZ-E6型榨汁机(九阳股份有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

碳同位素标准物质Beet Sugar(IA-R005，δ13C值-26.03‰，英国Sercon公司)；丙酮、硫酸、氢氧化钙、DL-酒石酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；苹果酸(分析纯，上海梯希爱化成工业发展有限公司)；L-酒石酸、柠檬酸(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。0.1 mol/L 硫酸溶液：取2.8 mL浓硫酸用水稀释至500 mL。

152个葡萄样品来自于果园和超市，均产自约北纬20°～北纬50°范围的主要葡萄产区，包括新疆、甘肃、内蒙古、宁夏、陕西、山西、辽宁等国内产区以及法国、意大利、西班牙、智利、美国等国外产区。葡萄种类涵盖赤霞珠、蛇龙珠、品丽珠、梅鹿辄、神索、百香、佳美、歌海娜、果若、黑品乐、佳丽酿、弥生、内比奥罗、桑娇维塞、增芳德、巨峰、甬优一号、美人指、夏黑、酔金香等。

85个市售葡萄汁样本来自超市或者果汁生产企业，标签上均标明为100%葡萄汁样本。糖浆为玉米糖浆和大米糖浆，均来自国内糖浆生产企业。

1.2样品前处理

1)在现阶段高速公路风险管理中安全文化尚未完全体现其重要性，仍仅局限于传统安全教育培训. “知行合一”的哲学观念要求，风险管理理念与风险管理实践要居于同等重要的地位，风险管理的发展需要先进安全文化的支撑.

选取新鲜、饱满、无病斑、整粒的葡萄，去皮去籽，放入榨汁机中榨取纯正葡萄汁。样品前处理过程部分参考果汁中糖和果肉δ13C值的检测标准[16-17]。

取50 mL葡萄汁样品，于3 000 r/min离心5 min后取上清液，以除去果汁中的固体果肉成分。上清液中加入2.0 g氢氧化钙，并在90 ℃水中煮3 min以沉淀有机酸。再以3 000 r/min离心5 min，所得上清液和沉淀分别用于果汁中δ13CS和δ13CO的测定。

果汁中δ13CS的测定：所得上清液用0.1 mol/L 硫酸溶液调至pH 5.0，于4 ℃过夜沉淀，用5 μL微量进样器移取1 μL上清液至5 mm×3.5 mm锡杯中，待测。

果汁中δ13CO的测定：所得有机酸沉淀用40 mL水洗3次(以除去残留糖)，然后用40 mL丙酮洗3次(以除去脂质)，所得沉淀于75 ℃下恒温干燥后，称取约0.1 mg至5 mm×3.5 mm锡杯中，待测。

每个样各组分平行测定2次，取平均值，绝对差小于0.30‰。

1.3实验条件

1.3.1元素分析仪条件氧化管温度：950 ℃；还原管温度：680 ℃；气相色谱柱温箱温度：50 ℃；载气：高纯氦气，流速：120 mL/min；燃烧气：高纯氧气，流速：100 mL/min；燃烧时间：3 s。

1.3.2同位素质谱条件离子源：电子轰击离子化(EI)；氦气压力：1.0 bar；参考气二氧化碳压力：1.0 bar；离子源电压：2.97 kV；真空度：1.8×10-6mbar。

2　结果与讨论

样品的δ13C值由Isodat 3.0软件直接给出。δ13C值的计算基于国际标准物质Vienna peedee belemnite standard(VPDB)[18]，计算公式为：δ13C=(Rsample-RVPDB)/RVPDB×1 000，其中Rsample为样品的13C与12C的同位素比值13C/12C，RVPDB=0.011 237 2。

在测定样品时，每间隔10个样品需测定1次碳同位素标准物质Beet Sugar进行系统稳定性评价，要求所测得的δ13C值与证书标明值相差小于0.30‰。

2.1葡萄汁中糖及有机酸分离过程的优化

纯正葡萄汁的主要成分是糖和有机酸。由于来源相同的各个组分的δ13C值十分接近，所以纯正葡萄汁中糖和有机酸的δ13C值差异较小，而掺入碳-4植物来源的糖或有机酸均会造成二者的δ13C差值增大，使得该参数超出合理范围，因此本研究需将糖和有机酸两者有效分离来进行测定。

通过加入氢氧化钙与有机酸反应形成沉淀后离心，上清液中为糖，沉淀为有机酸钙盐，从而实现两者的分离。氢氧化钙加入量过少会使有机酸沉淀不完全，进而影响糖的δ13C值测定，而加入量过多则会造成试剂浪费。因此，本文对氢氧化钙的加入量进行了优化。选取1个纯正葡萄汁样本，在初步离心除去果肉后的50 mL澄清样品中加入氢氧化钙(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g)，分别测定δ13CS和δ13CO。结果表明，在不同加入量情况下，δ13CO值的变化很小，其值为-26.34‰～-26.18‰。当加入量为1.0 g和1.5 g时，δ13CS值相对明显偏负(-25.47‰～-25.39‰)，这是由于有机酸未完全沉淀，上清液中含有δ13C值相对偏负的有机酸，当加入量为2.0 ～3.0 g时，糖的δ13CS值趋于稳定(-24.74‰～-24.52‰)，表明有机酸已完全沉淀。因此实验选取氢氧化钙的加入量为2.0 g。

2.2EA-IRMS法测定纯正葡萄汁

采用EA-IRMS法对152个纯正葡萄汁的δ13CS和δ13CO进行测定，所得结果如图1，可以看出纯正葡萄汁中δ13CS范围为-26.92‰～-24.16‰，而δ13CO的范围为-27.56‰～-24.99‰，两个参数的结果大致呈正态分布且表现出典型的碳-3代谢产物特征。计算得Δδ13CO-S在-1.63‰～0.72‰范围内，而可能掺入的碳-4代谢产物的典型δ13C值一般在-20‰～-9‰范围内，一旦其掺入纯正葡萄汁中将会使Δδ13CO-S超出上述合理范围。

为了验证方法重现性，选取1个纯正葡萄汁，连续15 d检测该样本的δ13CS和δ13CO值，计算所得的相对标准偏差(RSD)分别为0.20%和0.21%，可见本方法的数据重现性较好，能满足葡萄汁中糖和有机酸δ13C值的检测要求。

2.3EA-IRMS法在纯正葡萄汁掺假鉴别中的应用

2.3.1常见糖浆及糖浆掺假葡萄汁的测定选取2种常见的糖浆(大米糖浆和玉米糖浆)进行掺假鉴别研究，其中大米糖浆为碳-3植物糖，而玉米糖浆为碳-4植物糖。在1个纯正葡萄汁样本中分别掺入大米糖浆和玉米糖浆，掺入比例均为15%，标为掺假葡萄汁1和掺假葡萄汁2。采用EA-IRMS测定两个样本的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S，结果显示，掺假葡萄汁1的δ13CS相对于纯正葡萄汁偏正，导致Δδ13CO-S为-4.85‰，超出纯正葡萄汁的Δδ13CO-S合理范围(-1.63 ‰～0.72 ‰)。而掺假葡萄汁2的Δδ13CO-S未超出上述范围，因此，本方法对于碳-4来源的糖浆掺假有很好的鉴别能力，而对于碳-3来源的糖浆掺假则需进一步研究。

为了进一步验证方法的有效性，选取1个纯正葡萄汁与1个玉米糖浆(δ13C=-14.56‰)按照不同的比例混合，分别测定该样的δ13CS，δ13CO和Δδ13CO-S值。从图2可以看出，当掺入玉米糖浆比例达8%时，计算得Δδ13CO-S<-1.63‰，即被鉴定为掺入碳-4植物糖。因此当掺糖比例不低于8%时，采用本方法即可被检出。

2.3.2常见有机酸及有机酸掺假葡萄汁的测定葡萄汁中含量较高的有机酸包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸，含量分别约为0.3%，0.15%和0.14%[19-21]。选取上述3种有机酸进行研究。首先采用EA-IRMS测定了L-酒石酸、DL-酒石酸、苹果酸和柠檬酸的δ13C值，测定结果分别为-19.36‰，-27.07‰，-25.6‰和-11.15‰。分别将L-酒石酸、DL-酒石酸、苹果酸、柠檬酸掺入1个纯正葡萄汁中，掺入比例分别为0.3%,0.3%，0.15%和0.14%，记为自制1～4(Self-made 1～4)。采用EA-IRMS测定这4个样本的δ13CS,δ13CO和Δδ13CO-S，结果见表1。

表1自制掺假葡萄汁中糖和有机酸的δ13C值

Table 1δ13CSandδ13COresults of self-made adulterated grape juice

/‰

从表1可以看出，掺入碳-3来源的自制2、自制3掺假葡萄汁的Δδ13CO-S未超出-1.63‰～0.72‰限定范围，而其他2个自制掺假葡萄汁样本的Δδ13CO-S均超出限定范围，被本方法有效鉴别。可见，本方法对于碳-4来源的有机酸掺假同样有效，但无法有效鉴别碳-3来源的有机酸掺假。

目前已有研究采用LC/EA-IRMS对碳-3来源的糖浆掺假进行鉴别[22],本课题组拟用LC/EA-IRMS对碳-3植物来源掺假进行后续鉴别研究。

2.3.3市售葡萄汁样品的测定根据上述葡萄汁掺假鉴别新方法，采用EA-IRMS对市售标明100%纯葡萄汁样品的真伪情况进行研究，85个样本采自超市或果汁生产企业。结果检测出阳性样品31个，阳性率达36.47%。

3　结　论

本文利用EA-IRMS法初步建立了纯正葡萄汁的碳同位素数据库，提出了鉴别葡萄汁掺假的新技术，通过对纯正葡萄汁的糖、有机酸的δ13C值进行测定，进一步分析二者δ13C值的差异，该方法能有效地鉴别出葡萄汁掺入的外源性碳-4植物糖和有机酸。对市售葡萄汁样品进行了检测，阳性检出率为36.47%，虽然对碳-3植物糖和有机酸的掺假检测性能有待改善，但新方法在葡萄汁掺假鉴别的灵敏度方面显示了较大优势，有较好的应用前景。

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Identification of Authentic Grape Juice Adulteration Using Elemental Analysis-Carbon Isotope Ratio Mass Spectrometry

TAN Meng-ru1,FEI Xiao-qing2*,WU Bin2,SHEN Chong-yu2,ZHANG Rui2,DING Tao2,LIU Yun2,YANG Gong-jun1*

(1.College of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing211198,China;2.Laboratory of Food,Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing210001,China)

A new research for authentic grape juice adulteration identification using elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry(EA-IRMS) was developed.The carbon isotope ratio values(δ13C values) for 152 grape samples from different production regions were collected to primarily construct the isotopic database of authentic grape juices.The results indicated that theδ13C values of sugar and organic acid were in the ranges of -26.92‰-24.16‰ and-27.56‰-24.99‰，respectively.Based on the aboveδ13C values collected,theδ13C value limit for the authentic grape juice was proposed:theδ13C difference between organic acid and sugar Δδ13CO-Sshould be from-1.63‰ to 0.72‰.According to the above criteria,among 85 commercial samples,31 samples were confirmed adulterated with C-4 plant sugar or organic acid.According to the syrup addition test,EA-IEMS method could identify over 8%C-4 plant sugar adulteration.The newly developed method represented a significant potential application in the quality assurance of grape juice.

elemental analyzsis;isotope ratio mass spectrometry;grape juice adulteration;C-4 plant sugar

2015-12-10；

2016-02-15

江苏出入境检验检疫局科技计划项目(2015KJ31)；国家自然科学基金资助项目(21275162)；“青蓝工程”资助项目

杨功俊，博士，教授，研究方向：现代仪器分析，Tel：025-84589700，E-mail：gjyang@cpu.edu.cn

费晓庆，硕士，工程师，研究方向：食品分析与食品掺假鉴别，Tel：025-52345193，E-mail:dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.018

O657.63;S663.1

A

1004-4957(2016)08-1031-05