高效液相色谱-串联质谱法测定大米与小米中柄曲霉素残留

赵亚荣，石阶平，黄健祥,王富华*

(1.农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室，广东　广州　510640；2.广东省农业科学院　农产品公共监测中心，广东　广州　510640；3.中国农业大学　食品科学与营养工程学院，北京　100083)



高效液相色谱-串联质谱法测定大米与小米中柄曲霉素残留

赵亚荣1,2,3，石阶平3，黄健祥1,2,王富华1,2*

(1.农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室，广东广州510640；2.广东省农业科学院农产品公共监测中心，广东广州510640；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

通过优化提取溶剂及其体积、超声时间及吸附剂，建立了一种快速、简单、准确测定大米和小米中柄曲霉素的分析方法。以乙腈为提取溶剂，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂净化，上清液过膜后进行分析，在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)模式进行测定。结果表明，柄曲霉素在0.1～100.0 μg/L范围内呈良好的线性，相关系数不低于0.999 0。大米中柄曲霉素的检出限为0.03 μg/kg，定量下限为0.1 μg/kg，回收率为88.3%～91.5%，相对标准偏差(RSD)为2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的检出限为0.1 μg/kg，定量下限为0.3 μg/kg，回收率为92.7%～103.8%，RSD为2.2%～6.9%，符合痕量分析的要求。采用该方法分析收集的大米和小米样品，均未检出柄曲霉素。

柄曲霉素；大米；小米；高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)

柄曲霉素(Sterigmatocystin，STC)是由杂色曲霉(Aspergillusversicolor)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)等真菌产生的次级代谢产物，具有潜在的致癌性、致突变性和致畸性。其结构与黄曲霉毒素B1(AFB1)高度相似(如图1)，基本结构组成为二呋喃环和氧杂蒽酮[1]。食物、饲料、屋内污垢物品是真菌产生STC的主要载体，一些植物和哺乳动物病原体也会导致STC的产生[2]。研究表明，在大鼠和猴子体内，STC的致死剂量约为AFB1的1/10；STC在大鼠体内引起肝癌所需的剂量比AFB1低1～2个数量级[3]。因此，国家癌症研究中心(IARC)将其分为2B级致癌物[4]。大米作为我国的主粮之一，含有丰富的营养物质；小米作为健康食品，营养价值丰富。二者在生产、加工及储存过程中均可能受到真菌污染，产生真菌毒素，因此，有必要建立一种简便、灵敏、快速分析大米和小米中柄曲霉素的方法以保障消费者健康。

目前检测柄曲霉素的方法主要有酶联免疫吸附测定法(ELISA)和色谱法。ELISA灵敏度高，特异性好，提取方法简单，回收率好，一次实验可检测多个样品；但由于STC在样品中含量低，免疫原性弱，存在交叉反应且特异性抗体制备困难，使其在STC含量检测中应用较少[5-6]。而色谱法主要包括薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[7-11]。TLC由于操作简单、所用试剂便宜等优点，曾广泛用于真菌毒素检测。中国卫生部颁发的食品中STC检测的标准方法即为TLC技术[12]，但该方法存在检测周期长、灵敏度较差、无法实现自动化等缺点，且柄曲霉素自身荧光性较弱，检测时需衍生，操作复杂，易产生干扰，因此目前应用较少。HPLC-MS/MS具有选择性好、抗干扰能力强、灵敏度高等特点，近几年成为广泛应用的定量检测方法。样品前处理作为检测技术的重要环节，对降低基质效应、提高方法的准确度和灵敏性起着关键性作用。因此，高效的样品净化技术成为痕量分析的重要因素。基于抗原抗体反应的免疫亲和柱(IAC)尽管能够保证基质净化效果以及准确检测微痕量目标物[13]，但其价格较高。本研究结合操作简单、成本低的QuEChERS前处理过程，采用HPLC-MS/MS技术，建立了一种高效、快速、准确的柄曲霉素定量分析方法。

1　实验部分

1.1样品、仪器与试剂

大米和小米样品购自超市。取约500 g样品打碎，过20目筛，置于干燥环境中备用。

高效液相色谱仪(LC-30AD)、带电喷雾离子源三重四极杆质谱仪(LCMS-8050)，XR-ODS Ⅲ C18色谱柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)均购自日本岛津公司；Milli-Q 去离子水发生器(A10 System，美国 Millipore 公司)；0.22 μm有机滤膜(天津津腾公司)；AL204电子分析天平(上海梅特勒-托利多公司)；YB-600A高速多功能粉碎机(浙江运邦公司)；H2050R高速离心机(湖南湘仪公司)；HU20500B超声仪(天津恒奥公司)；QL-866涡旋仪(海门其林贝尔公司)。柄曲霉素标准品(纯度≥99%，美国Sigma公司)；乙腈(HPLC级，美国Merck公司)；甲酸(纯度≥98%，质谱用，美国Sigma公司)；氯化钠和无水硫酸镁均为国产分析纯试剂。

1.2实验方法

1.2.1柄曲霉素标准溶液的配制用乙腈溶解5 mg柄曲霉素标准品，配制成500 mg/L的柄曲霉素标准储备液，置于-20 ℃保存。

1.2.2样品提取与净化称取大米和小米样品各5.0 g(精确至0.01 g)，分别置于50 mL离心管中，加入柄曲霉素标准溶液，室温下放置过夜后取出，加入25 mL乙腈，旋涡1 min，超声7 min，加入1 g无水MgSO4和1 g NaCl，旋涡1 min，离心5 min(4 500 r/min)。取上清液，加入50 mg PSA，旋涡1 min，离心5 min(4 500 r/min)。取上清液，过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS检测。

加标样品：称取5.0 g(精确至0.01 g)空白样品，按照上述过程提取，用提取上清液配制浓度依次为0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100 μg/L的基质标准溶液。

1.2.3实验条件液相色谱条件：XR-ODS Ⅲ C18色谱柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，10% B；1～6 min，10%～95% B；6～6.1 min，95%～10% B；6.1～9 min，10% B；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

质谱条件：电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测(MRM)；离子源接口温度300 ℃；脱溶剂温度250 ℃；加热块温度400 ℃；雾化气流速3 L/min；加热气流速10 L/min；干燥气流速10 L/min；使用[M+H]+(m/z324.6)作为母离子,子离子分别为310.0(25 eV)和281.0(36 eV)，其中m/z310.0为定量离子。

2　结果与讨论

2.1前处理条件的优化

合适的样品前处理可达到去除基质干扰、富集目标物、定量转换等目的[14]。提取过程中加入无水硫酸镁和氯化钠能够产生盐析效应，使基质中亲水性成分的溶解度降低，促使溶剂相和水相分离，从而提高提取效率，此外，已有研究表明，一些吸附剂的加入会造成部分目标物的损失[15]。本研究分别从提取剂组成和体积、超声时间、吸附剂类型等方面对前处理过程进行了优化。

2.1.1提取溶剂及体积的影响提取剂对样品回收率的影响较大，真菌毒素的常用提取溶剂有乙腈、甲醇、乙腈-水以及甲醇-水。据文献报道，在相同样品中添加同样浓度的标准样品，采用乙腈作为提取剂时回收率较甲醇高[9-10]。参照上述文献，本文分别以乙腈、乙腈-水(84∶16，90∶10)混合溶液作为提取溶剂，对加标浓度为100 μg/kg的大米样品按“1.2.2”方法进行处理后，采用HPLC-MS/MS进行测定。结果表明，以乙腈为提取溶剂时，柄曲霉素的提取效果最佳。而以乙腈-水(84∶16)为提取溶剂时，柄曲霉素的回收率达140%，这与Versilovskis 等的实验结果不同[8,16]。进一步考察了不同体积(10，20，25 mL)乙腈提取时对目标物回收率的影响，结果显示，当乙腈体积为25 mL时，样品的提取效果最好，回收率为105.6%。

2.1.2超声时间的影响在相同条件下，考察了提取超声时间(3,5,7,10 min)对目标物回收率的影响。结果显示，柄曲霉素的回收率分别为91.4%，93.2%，94.5%和95.1%，回收率随着超声时间的延长而提高。但当超声时间超过7 min后，回收率增加不明显，且延长超声时间会使超声仪中的水温升高，影响目标化合物的回收率。综合考虑样品处理时间等因素，最终选择7 min作为超声时间。

2.1.3吸附剂的影响考察了C18、弗罗里硅土、石墨化碳黑和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 4种吸附剂对回收率的影响，结果见图2。从图中可以看出，PSA作为吸附剂时，样品中柄曲霉素的回收率最好。这是由于PSA具有弱的阴离子交换能力，主要通过氢键与化合物结合，可有效吸附脂肪酸、部分色素、糖和有机酸，此外PSA还同时具有一级和二级胺，与化合物的结合能力最强。而当以石墨化碳黑作为吸附剂时，回收率最差。这可能是因为石墨化碳黑的表面六边形结构使其对平面分子或含有平面芳香环的分子具有强烈的吸附作用，由于柄曲霉素结构中含有呋喃环，因此可被石墨化碳黑吸附从而使柄曲霉素的回收率降低。弗罗里硅土是硅胶键合氧化镁的吸附剂，与硅胶相似，是强极性吸附剂，主要适用于脂肪量高的样品。C18吸附剂是硅胶基质上接有十八烷基，具有较高的碳含量，可去除大量的油脂和非极性物质，常被用作净化剂[17]。综合回收率和RSD结果，最终选择PSA作为吸附剂。

2.2工作曲线、检出限与定量下限

以样品空白提取液配制柄曲霉素浓度在0.1～100.0 μg/L的系列标准溶液，以HPLC-MS/MS的峰面积为纵坐标(y)、以基质标样浓度为横坐标(x,μg/L)绘制标准曲线。以3倍信噪比作为方法的检出限(LOD)，以10倍信噪比作为方法的定量下限(LOQ)。得出大米基质的线性方程为y=26 915x+15 548，r2=0.999 0，LOD为0.03 μg/kg，LOQ为0.1 μg/kg；小米基质的线性方程为y=21 009x+15 031，r2=0.999 0，LOD为0.1 μg/kg，LOQ为0.3 μg/kg。图3为大米加标样品10 μg/kg的色谱图。

2.3回收率与相对标准偏差

称取大米、小米样品各5 g，分别置于50 mL离心管中，添加柄曲霉素标准溶液，旋涡混匀，使其在大米和小米中的加标水平为定量下限的1倍、5倍和10倍，室温放置，过夜。依照“1.2.2”方法进行样品前处理，利用HPLC-MS/MS分析。每个样品做5个平行，计算其加标回收率。结果见表1，大米中柄曲霉素的回收率为88.3%～91.5%，相对标准偏差(RSD)为2.3%～6.0%；小米中柄曲霉素的回收率为92.7%～103.8%，RSD为2.2%～6.9%。方法的准确度及精密度符合定量分析要求。

2.4日间精密度

称取大米、小米样品各5 g，添加STC标准溶液，使样品中STC的含量为100 μg/kg，按照“1.2.2”方法进行前处理并采用HPLC-MS/MS分析，每隔3 d平行测定1次，每个样品做5个平行，测得大米和小米样品的方法日间精密度分别为6.0%和7.4%。

2.5实际样品分析

分别对采集自黑龙江的2013年20份大米样品、广东省的2013年40份大米样品、广东省的2014年40份大米样品及内蒙古、山西等地不同年份26份小米样品进行测定，所有样品均未检出柄曲霉素。来自黑龙江的样品于-18 ℃保存两年，保存温度偏低，不利于产毒素菌株的生长和代谢；而广东省80份样品均保存在干燥、通风的环境中，同样不利于真菌的生长。小米样品中，有保存3年及3年以上的样品，其中部分肉眼可见已发霉，但未检出柄曲霉素，这可能是因为小米中真菌代谢未产生柄曲霉素或柄曲霉素含量低于本方法检出限。

3　结　论

建立了大米和小米中柄曲霉素的高效液相色谱-串联质谱分析方法。该方法样品前处理简单快速，其准确度、精密度、线性关系和灵敏度满足真菌毒素的分析要求，为提高农产品质量安全水平提供了良好的技术支持。

[1]Yuan J.StudyonDeterminationofSterigmatocystininGrainsbyHPLC.Nanjing：Nanjing University of Finance and Economics (袁建.高效液相色谱法测定粮食中杂色曲霉毒素的研究.南京：南京财经大学),2010.

[2]Rank C,Nielsen K F,Larsen T O,Varga J,Samson R A,Frisvad J C.FungalBiol.,2011,115(4/5):406-420.[3]Versilovskis A,Saeger S D.Mol.Nurt.FoodRes.,2010,54(1):136-147.

[4]International Agency for Research on Cancer (IARC).Some Naturally Occurring Substance:Food Items and Constituents,Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins.1993,56:245-540.

[5]Fang G F,Wang X C,Tao N P,Xin S P,Lu Y.J.Instrum.Anal.(方国锋,王锡昌,陶宁萍,辛少平,卢瑛.分析测试学报),2014,33(12):1447-1452.

[6]Li M,Li P W,Wu H,Zhang Q,Ma F,Zhang Z W,Ding X X,Wang H L.PlosOne，2014,9(9):e106415.

[7]Scott P M,Walbeek V W,Kennedy B,Anyeti D.J.Agric.FoodChem.，1972,20(6):1103-1109.

[8]Versilovskis A,Bartkevics V,Mikelsone V.FoodChem.,2008,109(1):243-248.

[9]Guo L Q,Gong X M,Ding K Y,Wang K,Sun J,Zhao H.J.Instrum.Anal.(郭礼强,宫小明,丁葵英,王可,孙军,赵晗.分析测试学报),2015,34(2):141-146.

[10]Cao Y,Sun L,Wang M L,Feng F,Chu X G.J.Instrum.Anal.(曹娅,孙利,王明林,冯峰,储晓刚.分析测试学报),2013,32(2):150-155.

[11]Tanaka K，Sago Y,Zheng Y Z,Nakagawa H,Kushiro M.Int.J.FoodMicrobiol.2007,119(1/2):59-66.

[12]GB/T 5009.25-2003.Determination of Sterigmatocystin in Vegetable Foods.National Standards of the People’s Republic of China (植物性食品中杂色曲霉素的测定.中华人民共和国国家标准).

[13]Li J,Ma F,Li P W,Zhang Q,Ding X X,Zhang W.J.Instrum.Anal.(李静,马飞,李培武,张奇，丁晓霞,张文.分析测试学报),2014,33(10):1095-1101.

[14]Zhong Q S,Hu Y F,Li G K.J.Instrum.Anal.(钟启升,胡玉斐,李攻科.分析测试学报),2013,32(5):643-652.[15]Hu W Y,Xu L,Yang J,Ling R.Chin.J.Chromatogr.(胡文彦,许磊,杨军,凌睿.色谱),2014,32(2):133-138.[16]Versilovskis A,Bartkevics V.MycotoxinRes.,2012,28(2):123-129.

[17]Yi J H,Duan Z J,Fang G Z,Cao M R,Wang S.Int.J.FoodSci.Technol.(易江华,段振娟,方国臻,曹梅荣,王硕.中国食品学报),2013,13(2):153-158.

Determination of Sterigmatocystin in Rice and Millet by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Ya-rong1，2，3,SHI Jie-ping3,HUANG Jian-xiang1,2,WANG Fu-hua1,2*

(1.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-product Safety and Quality,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510640,China；2.Public Monitoring Center for Agro-product of Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou510640,China；3.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083,China)

Sterigmatocystin,a mycotoxin produced by fungi and widely distributed in cereal food,has a potential toxic effect to human and animals with risk on food safety.In this study,a rapid,simple and accurate high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the analysis of sterigmatocystin in rice and millet by optimizing extraction solvent and its volume,ultrasonic time and adsorbent.The samples were extracted with acetonitrile,and cleaned up with PSA,then detected after the supernatant was filtered through nylon filter.The detection was performed in the electrospray ion(ESI) positive mode and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The sterigmatocystin showed good linear relationships in the range of 0.1-100.0 μg/L with correlation coefficients not less than 0.999 0．The limit of detection(LOD) and the limit of quantitation(LOQ)for sterigmatocystin in rice were 0.03 μg/kg and 0.1 μg/kg,respectirely,the recoveries ranged from 88.3% to 91.5% with relative standard deviations(RSDs) of 2.3%-6.0%.The LOD and LOQ for sterigmatocystin in millet were 0.1 μg/kg and 0.3 μg/kg,respectively,and the recoveries were 92.7%-103.8% with RSDs of 2.2%-6.9%.The proposed method could meet the requirement for trace analysis.The method was applied in the the detection of the collected rice and millet samples,and no sterigmatocystin was detected.

sterigmatocystin;rice;millet;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2016-01-04；

2016-01-26

农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室开放课题项目(NK201501)

王富华，研究员，研究方向：农产品质量安全，Tel：020-85161430，E-mail：wfhwqs@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.020

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2016)08-1041-05