基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

贵莉莉

(新乡职业技术学院，河南　新乡　453000)



基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

贵莉莉*

(新乡职业技术学院，河南新乡453000)

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素，PicoGreen染料传导互补双链的荧光信号。PicoGreen是一种不对称菁，当其单独存在时不产生荧光信号，而当其被吸附到互补的双链DNA上时，可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时，却无明显的信号改变。基于该性质，将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，相关系数(r2)为0.99，检出限为1.0×10-14mol/L。1.0×10-8mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测，表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测，其平均回收率为97%～102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶，有望用于医学临床诊断等领域。

核酸适配体；生物传感器；荧光；凝血酶

凝血酶是一种普遍存在于哺乳动物体内的蛋白质，其相对分子质量为36.7 kDa，等电位点为7.05。凝血酶具有类似激素类的性质，它涉及到血栓的形成和血小板的活性。因此，凝血酶在许多心血管疾病诊断中起到非常重要的作用[1]，同时它被认为在炎症和细胞壁的修复进程中起调节作用。血液中的凝血酶在pmol/L浓度范围内即可与疾病有相关作用，如血管生成、肿瘤生长和转移的诊断[2]，因此在痕量水平高灵敏度检测凝血酶具有重要的意义[3]。

适配体[4-6]本质上是单链寡核苷酸片段，为单链DNA或RNA，可与靶分子高特异性、高亲和力结合。适配体是在体外人工合成随机寡核苷酸文库，由指数级富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选产生。适配子能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合[7]。而DNA的一些二级结构(如发夹、茎环、凸环、G-四面体等)可使核酸分子形成多种三维结构，成为与靶物质特定区域结合的基础。目前生物分子检测通常采用抗原抗体特异性识别模式，但由于受到抗体易失活、制备时间较长等因素的影响，其应用受到限制。相比之下，核酸适配体因具有高特异性、高亲和力、靶分子广、体外合成、易于修饰、稳定性好、可反复变性、复性的优点而被广泛关注。

目前关于凝血酶的检测方法有电化学法[8-9]、电化学发光法[10]、表面增强拉曼光谱法[11]、荧光法[12-14]等。这些检测方法或仪器昂贵、操作复杂，或检测范围有限，易受环境影响，检测灵敏度不高。而本文采用无标记的适配子荧光法检测凝血酶，具有仪器操作简单、灵敏度高、检测范围宽等优点。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

核酸适配体(5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3’)购自上海生工生物有限公司。染料PicoGreen购自北京美莱博医学有限公司。凝血酶、牛血清蛋白和细胞色素C购于Sigma公司。Tris缓冲液(0.02 mol/L，pH 7.4)，其中含0.001 mol/L MgCl2，0.001 mol/L CaCl2，0.14 mol/L NaCl和0.005 mol/L KCl。实验用水为超纯水(艾科浦公司生产的实验室级超纯水)。

F-4500荧光分光光度计(Hitach公司，日本)。

1.2实验原理

PicoGreen试剂是一种非对称的花青染料，当其单独存在或者结合单链DNA时，不产生荧光信号；而当其结合双螺旋DNA时，由于PicoGreen能特异性嵌入互补双链DNA的小沟槽中，可产生比单独结合单链DNA时高1 000倍的荧光信号[15-17]。本文据此设计了一个新颖、简单的荧光适配体生物传感器以检测凝血酶，分子识别与检测原理如图1所示：凝血酶的存在造成单链DNAⅠ发生构象变化，并与目标物结合形成G-四面体结构。当与DNAⅠ完全互补的单链DNA Ⅱ不存在时，PicoGreen染料不产生荧光信号；然而，当在该混合溶液中加入DNA Ⅱ时,DNA Ⅱ和未与凝血酶结合的DNA Ⅰ形成双螺旋互补结构，PicoGreen染料嵌入到DNA Ⅱ-DNAⅠ双螺旋结构中，导致荧光强度显著增强，该荧光强度与目标物浓度成反比。

2　结果与讨论

2.1凝血酶检测条件的优化

2.1.1溶液pH值的优化在反应体系中，不同pH值的缓冲液对荧光强度的检测具有显著影响。实验分别考察了pH 7.4，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6的Tris缓冲溶液对凝血酶荧光强度检测的影响(图2)。结果表明pH 8.2的缓冲液稀释效果最好。

2.1.2PicoGreen与双螺旋DNA的反应时间反应时间对双螺旋DNA与PicoGreen的结合能力会产生一定的影响。将双螺旋DNA、PicoGreen与1.0×10-13mol/L凝血酶的反应体系置于不同时间下反应，检测荧光信号变化值。结果显示，反应15 min时荧光信号达到饱和。因此，PicoGreen和双螺旋DNA的最佳孵化时间为15 min。

2.2灵敏度与线性范围

在最优实验条件下，利用适配体传感器荧光法检测凝血酶，发现凝血酶浓度越高，与凝血酶结合的适配体Ⅰ就越多，导致和适配体Ⅱ互补的适配体Ⅰ越少，因此荧光强度越小(图3)。在1.0×10-14～1.0×10-7mol/L范围内，凝血酶浓度(c，mol/L)的对数值与荧光强度变化(ΔF=Fo-F)呈线性关系(图3插图)，其线性方程为ΔF=240.03+17.60lgc，相关系数(r2)为0.99，凝血酶的检出限为1.0×10-14mol/L。表1比较了不同方法对凝血酶的检测结果，结果显示，本文建立的传感方法呈现了更高的灵敏度。

2.3特异性研究

考察了本方法对凝血酶检测的特异性，将1.0×10-8mol/L牛血清蛋白(BSA)、细胞色素C(Cyt C)分别与实验所用的核酸适配体在相同条件下反应，并检测其相对于荧光背景的荧光信号变化(图4)。结果显示，相对于背景荧光强度，牛血清蛋白和细胞色素C产生了很小的荧光信号变化，而凝血酶产生了很强的荧光强度变化。考虑到生物分析体系是一个复杂的体系，当体系中存在与凝血酶适配体部分互补的适配体(5'-CCT TCC TCT GCA TCC-3’)时，则呈现出较强的荧光信号，但略低于PicoGreen嵌入完全互补的ssDNA Ⅱ-ssDNA Ⅰ所产生的荧光信号。当分别加入1.0×10-8mol/L牛血清蛋白、细胞色素C和凝血酶时，相对于加入部分互补链产生的背景荧光信号，加入凝血酶后产生的荧光强度明显降低，然而牛血清蛋白和细胞色素C对背景信号几乎无变化。表明本实验建立的荧光传感技术对于凝血酶分子检测具有较高的特异性。

2.4回收率实验

为了进一步检验该方法检测实际样品的可行性，取不含凝血酶的健康人血清，过滤后将血清样本稀释1 000倍，分别添加不同浓度(0.97×10-9，10.2×10-9，49.2×10-9mol/L)的凝血酶进行加标回收实验。结果显示，凝血酶在人血清样品中的平均回收率为97%～102%，相对标准偏差(RSD)不大于4.8%，说明本方法可用于实际血清样品中凝血酶的检测。

3　结　论

本文开发了一种基于适配体的凝血酶荧光检测方法，方法的检测灵敏度可达1.0×10-14mol/L，线性范围为1.0×10-14～1.0×10-7mol/L。与其他检测方法相比，该方法具有操作简便、准确可靠、灵敏度高的特点，可用于其他适配体的目标分子检测，并为后续荧光检测技术的应用奠定了基础。

[1]Stubbs M T,Bode W.Thromb.Res.,1993,69(1):1-58.

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[8]Cunningham J C,Brenes N J,Crooks R M.Anal.Chem.,2014,86(12):6166-6170.

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[13]Wang Y H,Bao L,Liu Z H,Pang D W.Anal.Chem.,2011,83(21):8130-8137.

[14]Chang H X,Tang L H,Wang Y,Jiang J H,Li J H.Anal.Chem.,2010,82(6):2341-2346.

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[17]Lv Z Z,Chen A L,Liu J C,Guan Z,Zhou Y,Xu S Y,Yang S M,Li C.PlosOne,2014,9(1):e85968.

Label-free Aptamer-based Fluorescent Detection of Thrombin

GUI Li-li*

(Xinxiang Vocational and Technical College，Xinxiang453000,China)

A simple and universal aptamer-based label-free approach for highly selective and sensitive fluorescence detection of thrombin was designed.The method is based on the specific recognition ability of label-free aptamer towards their targets,and PicoGreen dye was used to transduce the fluorescent signal of the double strand DNA duplex.As an asymmetric cyanine dye,PicoGreen reagent does not produce any fluorescence signal when it extsts alone.However,upon binding to dsDNA,it shows a significant fluorescence signal whereas no significant fluorescence change could be observed when it binds to ssDNA.Based on this property,it was used in the detection of thrombin.The results showed that a dynamic range of 1.0×10-14-1.0×10-7mol/L(r2=0.99) was obtained with a detection limit as low as 1.0×10-14mol/L.In order to determine the specificity of this method,the sensing system against two interfering substances such as bovine serum albumin(BSA) and cytochrome C(Cyt C) was tested.It is found that the interfering substances(each at 1.0×10-8mol/L) could not effect on the detection of thrombin,which indicated the high selectivity of the sensing method toward thrombin.The present method was successfully applied in the determination of thrombin in real human serum with average recoveries of 97%-102%.The experiments results demonstrated that the proposed method was simple,specific and sensitive,and it was hopeful to apply in the field of medical clinical diagnosis.

aptamer;biosensor;fluorescence;thrombin

2016-01-21；

2016-02-22

贵莉莉，硕士，讲师，研究方向：分析化学，Tel:0373-3720000，E-mail:40719606@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.023

O657.1；O629.8

A

1004-4957(2016)08-1054-04