25味常用清热解毒药提取物对猪源幽门螺杆菌的体外抑菌活性

荣 茜，代鹏飞，邓 林，秦红霞，李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)



25味常用清热解毒药提取物对猪源幽门螺杆菌的体外抑菌活性

荣 茜，代鹏飞，邓 林，秦红霞，李英伦

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

采用乙醇回流、超声波等方法提取金果榄等25味常用清热解毒中药的抗菌活性成分，分别测定它们对猪源幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration， MIC)，筛选出对猪源Hp具有良好体外抑菌效果的几味中药，并评价其体外联合抑菌效果。结果显示，黄连和青果的提取物对猪源Hp的MIC范围为1.56～3.12 mg·mL-1。金银花、金果榄、大青叶、玄参、山豆根、白头翁、紫花地丁、大黄和蒲公英提取物的MIC范围为12.50～25.00 mg·mL-1。大血藤、虎杖、射干、忍冬藤、菊花、鱼腥草、连翘、板蓝根、益母草、诃子和白蔹提取物的MIC范围为50.00～100.00 mg·mL-1。升麻、绵马贯众、柴胡提取物的MIC≥200.00 mg·mL-1。两两联合抑菌试验结果表明，青果和金果榄的联合抑菌指数(FICI)≤0.5，青果或金果榄分别与黄连联合的0.52。本研究表明，黄连、青果、金银花、金果榄对猪源Hp均有很强的体外抗菌活性，青果与金果榄为协同作用，青果或金果榄分别与黄连联合时为相加作用，黄连、青果、金果榄分别与金银花联合时均为拮抗作用。

猪源幽门螺杆菌；中药提取物；抗菌活性；体外

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是定植于动物胃黏膜表面与黏膜层之间的微需氧菌，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织瘤和胃癌的发生有着密切联系[1]。国内外关于Hp的研究多集中在人体上，对于家畜的Hp相关性疾病研究很少。流行病学调查显示，集约化猪场中猪胃溃疡病的发病率达38%，而四川地区的商品猪中发病率高达65%，猪场中Hp的检出率为30%～60%，由此可以推断Hp感染是造成猪胃溃疡病的重要因素之一[2-4]。目前，对于猪胃溃疡病的治疗主要采用改良猪种和抗生素治疗的方法。抗生素治疗存在预防效果不显著，治疗周期过长，效果不明显，以及药物残留严重等问题，使得猪胃溃疡病成为养猪业亟待解决的难题之一[5]。

中草药具有调节动物机体免疫力、杀灭或抑制细菌和病毒等作用，并具有低毒、低残留、不易产生耐药性等优点[6]。中兽医学认为，Hp感染属“邪气”范畴，且多具“热”“毒”性质，故应以清热解毒、扶正祛邪为治疗Hp相关性胃病的指导方针[7]。本研究以常用的25味清热解毒药的提取物为研究对象，通过研究其对猪源性Hp的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，筛选得到具有良好体外抗菌活性的中药提取物，然后通过棋盘稀释法研究不同中药提取物两两结合对猪源性Hp的体外抑菌效果，为进一步研制治疗猪胃溃疡病的中药组方制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株猪源性Hp菌株，编号SCYA201401，由四川农业大学动物医学院中兽医与中药学实验室自行分离，经PCR等方法鉴定为细胞毒素相关蛋白A基因阳性(CagA+)和细胞空泡毒素A基因阳性(VacA+)菌株。

1.1.2 药材黄连rhizoma coptidis(产地四川，批次：080406)、青果fructus canarii(产地四川，批次：100310)、金银花flos lonicerae(产地四川，批次：080919)、金果榄radix tinosporae(产地四川，批次：080406)、大青叶folium isatidis(产地四川，批次：100310)、玄参radix scrophulariae(产地陕西，批次：080919)、山豆根radix sophorae tonkinensis(产地四川，批次：080406)、白头翁radix pulsatillae(产地四川，批次：100310)、紫花地丁herba violae(产地四川，批次：100310)、大黄radix et rhizome rhei(产地四川，批次：080406)、蒲公英herba taraxaci(产地贵州，批次：100217)、大血藤caulis sargentodoxae(产地河南，批次：101114)、虎杖rhizome polygoni cuspidati(产地四川，批次：081102)、射干rhizoma belamcandae(产地四川，批次：101114)、忍冬藤caulis lonicerae(产地四川，批次：100826)、菊花flos chrysanthemi(产地四川，批次：080406)、鱼腥草herba houttuyniae(产地四川，批次：100310)、连翘fructus forsythiae(产地四川，批次：100310)、板蓝根radix isatidis(产地四川，批次：080406)、益母草herba leonuri(产地四川，批次：080312)、诃子fructus chebulae(产地云南，批次：090312)、白蔹radix ampelopsis(产地辽宁，批次：080919)、升麻rhizoma cimicifugae(产地四川，批次：080406)、绵马贯众rhizoma dryopteris crassirhizomatis(产地黑龙江，批次：101114)、柴胡radix bupleuri(产地河南，批次：100310)25味药材均购自四川成都惠民堂药业连锁有限责任公司，由四川农业大学动物医学院药学系范巧佳副教授鉴定均为正品。

1.1.3 培养基固体培养基为加有7%脱纤维绵羊血和选择性抗生素的哥伦比亚琼脂培养基，液体培养基为加有5%胎牛血清的布氏肉汤，所有材料均购自青岛市海博生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器设备和试剂超净工作台(苏州净化设备有限公司)、全自动高压灭菌锅(东南科仪有限公司)、KH-100B型超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)、电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、微需氧产气袋(三菱瓦斯化学株式会社)、密封培养罐(三菱瓦斯化学株式会社)，2， 3， 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，纯度≥95%，BIOSHARP)、二甲亚砜(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)、无水乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。

1.2 方法

1.2.1 药物有效成分的提取按照文献[8-31]的方法提取金果榄等25味中药的有效成分，金果榄、黄连、虎杖、蒲公英、鱼腥草、紫花地丁、白头翁、板蓝根、益母草、诃子、大青叶、玄参、山豆根、大黄、绵马贯众、柴胡、升麻和射干采用乙醇回流提取法，金银花、菊花和青果采用超声波提取法，连翘、大血藤、忍冬藤和白蔹采用水煎法提取。醇提液和超声提取液各自合并滤液后，浓缩制成浸膏，并计算浸膏得率。使用前将浸膏用适量二甲亚砜溶解，制成生药质量浓度为2 g·mL-1的药液；水提液合并滤液后用旋转蒸发仪浓缩至生药浓度为2 g·mL-1的药液。所有药液都需经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 Hp菌悬液的制备按文献[32]的方法将Hp SCYA201401接种于固体培养基上，于微需氧培养条件(5%O2，10%CO2，85%N2，湿度>98%)中37 ℃培养72 h，传代纯化后接种于液体培养基中，经麦氏标准比浊管比浊，制备成标准浊度约0.5的菌液(约1×108cfu·mL-1Hp菌悬液)。

1.2.3 药敏试验及结果判定取上述方法制备好的约1×108cfu·mL-1Hp菌悬液100 μL，用L型玻棒均匀涂布于整个固体培养基中，然后用无菌手术镊子在培养基正中放置直径6 mm牛津杯一个，向其中分别加入25 μL药液，操作时间必须控制于15 min内，然后将药敏平板放置于微需氧培养条件中培养72 h，观察抑菌圈，游标卡尺测量直径。每味中药提取物重复3次，取中位数。

参考相关文献制定药敏试验结果判定标准[33]，分为高度敏感：抑菌圈直径≥20 mm；中度敏感：10 mm≤抑菌圈直径<20 mm；低度敏感：6 mm<抑菌圈直径<10 mm；不敏感：无抑菌圈。

1.2.4 MIC测定改良文献[34]中采用的试管2倍稀释法：取12支灭菌试管，将其中1支作为阴性对照管，1支作为阳性对照管，其余10支作为试验组并依次编号。首先向试验组1号管加入药液2 mL，其余11支试管加入灭菌双蒸水1 mL。从1号管吸取1 mL药液至2号管中，混匀后从2号管取出1 mL至3号管中，依次类推，直至10号管，混匀后从10号管吸取1 mL弃去。然后，向所有12支试管中各加入4 mL的液体培养基，混匀。使得试验组1～10号试管的药物浓度依次为400.00，200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.12，1.56，0.78 mg·mL-1。最后，取出制备好的约1×108cfu·mL-1Hp菌悬液，在15 min内向试验组和阳性对照组的每一支试管中各加入100 μL菌悬液，置于微需氧培养条件中培养60 h。取出全部试管，每管分别加入5%TTC溶液100 μL，混匀后再次置于微需氧培养条件中培养12 h。以无显色反应的最低稀释度为该中药提取物的MIC。

1.2.5 体外联合抑菌试验及结果判定根据单味中药的体外抑菌结果，选择其中抑菌活性较强的几味中药提取物进行两两联合抑菌活性的研究。改良文献[35]中采用的琼脂稀释棋盘法为肉汤棋盘稀释法：以各中药提取物对应的4倍MIC，2倍MIC，1倍MIC，1/2倍MIC，1/4倍MIC 5个浓度分别进行联合抑菌试验。以金果榄和青果为例：取25支灭菌试管，5支一组，1～5组每组分别加入用灭菌双蒸水稀释好的4 MIC，2 MIC，1 MIC，1/2 MIC，1/4 MIC的金果榄药液各500 μL。然后，向每一组的5支试管分别加入用灭菌双蒸水稀释好的4 MIC，2 MIC，1 MIC，1/2 MIC，1/4 MIC的青果药液各500 μL。之后每支试管中各加入4 mL的液体培养基，混匀。加Hp菌悬液及后续操作同1.2.4节。

试验结果以联合抑菌指数(FICI)来判断联合效应[36]：

FICI=MIC(A)联合/MIC(A)单独+MIC(B)联合/MIC(B)单独当FICI≤0.5时为协同作用；0.52时为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 25味清热解毒中药提取物对猪源Hp的体外抑菌活性

25味清热解毒中药提取物对猪源Hp的体外抑菌结果见表1。

由表1可知，黄连、青果、金果榄和金银花4味中药提取物的抑菌圈直径≥20.00mm，MIC范围为1.56～12.50 mg·mL-1，抑菌效果最好。大青叶、玄参、山豆根等18味中药提取物的抑菌圈直径为10.00～20.00 mm，MIC范围为12.50～100.00 mg·mL-1，抑菌效果较好。升麻、绵马贯众和柴胡提取物的抑菌圈直径<10.00 mm，MIC范围≥200.00 mg·mL-1，抑菌效果差。

2.2 金果榄等4味中药提取物对猪源Hp的体外联合活性

通过单味药的体外抑菌结果，选择黄连、青果、金果榄和金银花提取物进行两两体外联合抑菌试验，结果见表2。

根据FICI值的判断标准，青果提取物和金果榄提取物的FICI≤0.5，为协同作用；黄连提取物和金果榄、青果提取物的0.52，为拮抗作用。

3 讨论

清热解毒药是一类临床应用极为广泛的中药，大量研究表明它们对许多细菌、病毒都具有抑制作用，但由于提取方法的不同导致结果差异性很大。众所周知，中药成分非常复杂，所以提取其中的有效成分的方法对于提高药效具有十分重要的作用。本研究根据25味清热解毒药的不同有效成分，分别采用文献报道中最佳的提取工艺，采用乙醇回流法、超声波提取法以及煎煮法对它们进行有效成分的提取，以求获得最大量的有效成分，从而使得药效达到最佳。

表1 25味清热解毒药提取物对猪源幽门螺杆菌的体外抑菌活性

Table 1 Antimicrobial activities of active ingredients extracts of twenty-five tradition antipyretic and antidote medicine toHelicobacterpylorifrom swineinvitro

中药提取物抑菌圈直径/mmMIC/(mg·mL-1)中药提取物抑菌圈直径/mmMIC/(mg·mL-1)黄连32.321.56虎杖16.5050.00青果35.503.12大血藤14.9250.00金银花24.9012.50忍冬藤14.2250.00金果榄21.2212.50菊花13.4250.00玄参19.2812.50诃子19.42100.00大青叶14.5412.50板蓝根18.40100.00紫花地丁16.4625.00白蔹10.82100.00大黄12.6025.00益母草10.48100.00白头翁11.4025.00连翘10.26100.00山豆根11.2025.00绵马贯众6.68200.00蒲公英10.9025.00升麻6.42200.00射干22.8050.00柴胡0.00>400鱼腥草17.3450.00

表2 四味中药提取物两两联合用药对猪源幽门螺杆菌的FICI

Table 2 The FICI to pairwise combination of active ingredients extracts of four herbs againstHelicobacterpylorifrom swine

联合药物MIC/(mg·mL-1)黄连青果金果榄金银花MIC单MIC合MIC单MIC合MIC单MIC合MIC单MIC合FICI作用效应黄连+青果1.560.783.120.780.75相加黄连+金果榄1.560.7812.506.251.00相加黄连+金银花1.560.7812.5025.002.50拮抗青果+金果榄3.120.7812.503.120.50协同青果+金银花3.126.2512.5012.503.00拮抗金果榄+金银花12.5012.5012.5025.003.00拮抗

25味常用清热解毒药的体外抑菌活性试验结果表明，除柴胡外的其他24种药物对猪源Hp都具有抑制作用，其中黄连、青果、金果榄、金银花的抑制作用最强。大部分结果与文献报道中它们对人源Hp的抑制作用基本一致，比较突出的是青果、金银花和菊花对猪源Hp的抑菌活性显著优于人源，可能是因为提取方法的不同导致的，即在超声波提取法下这3种药物的有效成分含量可能显著高于其他提取方法。Ma等[34]报道板蓝根对人源Hp有很好的抑菌活性，但在本研究中效果并不特别理想，根据胡晓燕等[37]报道的板蓝根抑菌的主要活性部位是总有机酸部位，分析是由于在乙醇回流提取过程有机酸成分的流失造成的抑菌效果降低。

联合抑菌试验结果显示，金果榄和青果联合可产生协同作用，抗菌作用非常明显，鉴于之前未见有报道将二者联合应用于Hp相关性胃病的治疗中，可以组成一个复方，用于猪，甚至人的Hp相关性胃病的治疗研究。有报道指出，2009年四川省青果年产量高达800万kg，已成为全国青果的主产区之一[38]。同时，四川省还是金果榄的主产地之一，生长着2种被药典收录的金果榄药材基源植物，特别是道地药材峨眉青牛胆(其块根入药即为金果榄)又被研究证明具有良好的抗炎抗菌活性。若将二者组方开发为临床用药，将具有原材料丰富、成本相对较低的天然优势。相关二者的后续研究应从其抑制Hp的机制入手，为Hp相关性胃炎、胃溃疡的治疗提供依据。

本研究改良了研究中药对Hp体外抑菌活性的方法，由于中药中成分复杂，其提取物大部分具有“黑”的特点，使得MIC范围难以准确界定。在Hp培养后期加入浓度为5%的TTC溶液，可使得抑菌结果更加准确直观。本研究还首次报道了中药对猪源Hp的体外抑菌活性，为兽医临床抗幽门螺杆菌的中药组方提供了参考，并指出了后续的研究方向。

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(责任编辑 卢福庄)

Effects of twenty-five traditional antipyretic and antidote medicine extracts against Helicobacter pylori from swine in vitro

RONG Qian， DAI Peng-fei， DENG Lin， QIN Hong-xia， LI Ying-lun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Using ethanol reflux， water decoction or ultrasonic method， extracts of 25 different traditional antipyretic and antidote medicines were obtained. Inhibition zone diameters of above 25 extracts onHelicobacterpylori(Hp) from swine were detected by Oxford cup method. Minimal inhibitory concentration(MIC) were detected by macrodilution broth method， and combined antibacterial effectsinvitroof them were also observed. MICs of the extracts obtained from rhizome coptidis， fructus canarii against Hp ranged from 1.56 to 3.12 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from flos lonicerae， radix tinosporae， folium isatidis， radix scrophulariae， radix sophorae tonkinensis， radix pulsatillea， herba violae， radix et rhizome rhei and herba taraxaci ranged from 12.50 to 25.00 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from caulis sargentodoxae， rhizome polygoni cuspidati， rhizoma belamcandae， caulis lonicerae， flos chrysanthemi， herba houttuyniae， fructus forsythiae， radix isatidis， herba leonuri， fructus chebulae and radix ampelopsis ranged from 50.00 to 100.00 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from rhizome cimicifugae， rhizome dryopteris crassirhizomatis and radix bupleuri exceeded 200.00 mg·mL-1. The results of pairwise joint bacteriostatic test showed that the fractional inhibitory concentration index (FICI) of the extracts from fructus canarii and radix tinosporea against Hp was less than or equal to 0.5. The FICI of fructus canarii/radix tinosporea with rhizome coptidis were more than 0.5， but less than or equal to 1. The FICI of fructus canarii/radix tinosporea/rhizome coptidis with flos lonicerae were more than 2. It was concluded that fructus canarii， radix tinosporea， rhizome coptidis， flos lonicerae showed a good antibacterial effect against Hpinvitro. The combination of fructus canarii and radix tinosporea was characterized by a synergism effect， whereas the combination of fructus canarii and rhizome coptidis， radix tinosporea and rhizome coptidis， respectively， was characterized by an additive effect. The combination of fructus canarii or radix tinosporea or rhizome coptidis with flos lonicerae showed a antagonism effect.

swine-derivedHelicobacterpylori; traditional Chinese medicine extract; antimicrobial activity;invitro

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.07

2015-05-29

四川省科技支撑计划(2013NZ0019)

荣茜(1990—)，女，在读硕士研究生，研究方向为药理学与毒理学。E-mail：rongqian1213@163.com

*通信作者，李英伦，E-mail：liyinglun01@163.com

S853.74

A

1004-1524(2016)01-0038-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):38-43

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