不同柑橘品种对链格孢褐斑病的感病性离体评价

符雨诗， 罗君琴， 徐建国， 李红叶

(1. 浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058； 2. 浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318020)



不同柑橘品种对链格孢褐斑病的感病性离体评价

符雨诗， 罗君琴， 徐建国， 李红叶

(1. 浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058； 2. 浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318020)

链格孢褐斑病(Alternariaalternatapv.citri)主要为害橘类，以及橘和柚，或橘和橙的杂交柑橘，引起落叶、落果、枯梢，带病果实因果面病斑而难以鲜销。文章应用该病菌的孢子悬浮液接种离体叶片法评价了42个柑橘品种对褐斑病的感病性，发现橘类中的太田椪柑、新生系3号椪柑、岩溪晚芦、红橘418、杨小2-6南丰蜜橘、乳橘、无核早橘、瓯柑和满头红均高度感病，少核本地早、朱红和砂糖橘表现免疫；杂柑中的明尼奥拉、奥尔兰多、诺瓦橘、卡拉橘、濑户香、天草、津之香和默科特高度感病，大谷伊予柑和西之香为轻微感病，而爱伦达尔、红玉柑、清见、不知火和南香免疫；橙类、柚和柠檬对褐斑病免疫；而温州蜜柑、常山胡柚和金柑等一些品种的感病性则有待进一步确定。

柑橘品种；链格孢褐斑病；感病性；离体评价

链格孢褐斑病(Alternariabrown spot， ABS)由交链格孢菌橘致病型(Alternariaalternatapathotype tangerine，也称A.alternatapv.citri)引起，主要为害一些橘类，以及橘和柚，或橘和橙的杂交柑橘，引起落叶、落果、枯梢，带病果实因果面病斑而难以鲜销[1-2]。由于ABS的严重发生，在地中海和美国佛罗里达州等一些地区，一些原来广泛种植的明尼奥拉(Minneola)等感褐斑病品种的种植面积正在不断减少，甚至面临淘汰的危险[3]。

已有研究表明，病菌产生的次生性代谢物(毒素)9，10-环氧-8-羟基-9-甲基癸三烯酸是链格孢褐斑病菌的关键致病因子，该毒素只特异性地对一些橘类品种柑橘，以及这些橘与柚或橙的杂交后代品种柑橘有毒性，即属于寄主选择性毒素(host selected toxin， HST)，简称ACT毒素[4-5]。已知编码ACT毒素合成的基因构成基因簇(gene clusters)，分布在一条大小约为2.0 Mb，对病菌菌丝生长和产孢并不重要的染色体(conditionally dispensable chromosome， CDC)上[5]。当孢子在易感组织(叶片，嫩梢以及果实)上萌发时，即释放ACT毒素，进入寄主细胞后，ACT毒素作用于细胞质膜，破坏质膜的完整性，导致电解质的渗漏，最终导致细胞的死亡[4]。此外，病菌拥有的高效活性氧清除系统，使得病菌能及时有效地清除其互作过程中寄主产生的活性氧，也是褐斑病菌致病所需的[6-7]。

自1903年在澳大利亚皇帝柑上首次发现ABS后，在美国佛罗里达州、以色列、哥伦比亚、土耳其等国家和地区陆续发现ABS，其引起了感病柑橘的严重损失[8-11]。在我国，对柑橘褐斑病的记载最早可追溯到1995年[12]，但直到2010年，其病原才得到实验确认[13]。目前，该病害已在我国重庆的红橘、广西和广东的贡柑、浙江的瓯柑，湖南、云南等地的椪柑，以及一些杂柑上报道，并已经成为这些地区感病柑橘生产上的重要问题[14-17]。

国外研究表明，在自然条件下，柑橘品种丹西橘(Dancy)、日辉(Sunburst)、橘柚明尼奥拉(Minneola)、奥尔兰多(Orlando)、诺瓦橘(Nova)、Lee、橘橙类默科特(Murcott)属于褐斑病的感病品种[3，18]，而克莱蔓丁橘则属于抗病品种。ABS病菌能轻微为害葡萄柚，但甜橙对ABS免疫[18-19]。离体叶片接种的寄主范围比自然条件下要宽，但离体叶片接种能部分反映自然条件下品种的抗感情况，因此也被用于柑橘品种，以及杂交后代的抗性评价[18]。中国是世界最重要的柑橘生产国，柑橘种植历史长达4 000多年。目前，中国生产的柑橘大部分进入鲜果市场，其中宽皮柑橘占相当大的比重，而在宽皮柑橘中，不少品种起源于中国，国外并没有对这些品种开展过抗褐斑病的评价。由于褐斑病在中国发现的历史很短，一些主栽品种对于褐斑病的抗性并无研究，作者于2013和2014年对浙江省柑橘研究所搜集的部分柑橘品种开展了褐斑病抗性的离体评价，旨在为评价褐斑病对我国柑橘产业潜在风险，预防该病害在感病品种主产区流行提供有价值的信息，并为抗褐斑病育种筛选抗源。

1 材料与方法

1.1 供试的柑橘品种和菌株

待测的42个柑橘品种均种植在浙江省柑橘研究所的资源圃中(浙江黄岩)，2013年7月采摘幼嫩的夏梢叶片进行接种，获得初步结果后，2014年4月再次采摘这些品种的春梢幼叶做进一步的验证。所用的褐斑病菌菌株分别为D1，Z5和H20，分别来自贡柑(广东)、瓯柑(浙江)和椪柑(湖南)，在基于endoPG部分基因序列的系统进化分析中，分别位于3个不同的遗传分枝，其致病性也在之前的研究中证实[20]。菌株均为单孢菌株，保存在PDA斜面，4 ℃冰箱。

1.2 孢子悬浮液的制备

接种用的大量分生孢子在V8培养基、25 ℃、16 h/8 h(L/D)条件下培养7～10 d后获得[21]。在培养皿(9 cm)中加5 mL无菌水，用事先消毒的三角玻棒轻轻刮擦培养基，促使孢子脱落，孢子悬浮液通过四层纱布过滤，以去除菌丝，通过血球计数器计数，将孢子浓度调整到105mL-1，备用。

1.3 抗性评价

2013和2014年的评价方法不同，2013年的接种方法参考Solel等[22]的方法。具体方法为：收集幼嫩的夏梢叶片(大小约为成熟叶片的50%)，自来水小心冲洗，晾干，平放于垫有吸水纸的培养皿上，叶背朝上。将直径4 mm的滤纸片在105mL-1的孢子悬浮液(菌株D1)浸润，转移到(贴在)幼叶的背面(图1)，以接种浸润无菌水的滤纸片为对照。在培养皿上覆上一层保鲜膜，转移至27 ℃的人工气候箱(16 h/8 h，L/D)中诱导发病，72 h后统计各品种叶片的发病情况。每一品种接种5张叶片，整个实验重复3次。

2014年的接种方法则参考了Vega等[23]。具体为：取离心管(1.5 mL)，去盖，装上适量的无菌水，排列在离心管架上，用封口膜将离心管开口封住，备用。采集幼嫩春梢(通常带3张幼叶，最大幼叶大约2/3展开)，刺穿封口膜插到离心管中，使大约5 mm幼梢浸入水中。将病菌的孢子悬浮液(105mL-1，菌株有D1，Z5和H20)用微小喷雾器(TLC Crown North American Professional Products)均匀地喷雾接种到幼嫩的春梢叶片上，对照喷无菌水。待叶片上的水珠基本干后，将离心管架转移到27 ℃的人工气候箱(16 h/8 h，L/D)中诱导发病，72 h后观察柑橘叶片的发病情况(图1)。每个品种，每个菌株接3个嫩梢，每个嫩梢接3张叶片。整个实验重复3次。

1.4 感病性确定

叶片的发病程度分级为：0级，没有病斑；1级，病斑面积<叶片总面积的20%；2级，病斑面积占整张叶片的21%～50%；3级，病斑面积>叶片总面积的50%[23]。病情指数(DI)/%=∑(Xi×Si)/(∑Xi×Smax)×100，其中Xi代表的是每一病害等级的叶片总数；Si代表的是病害等级，Smax代表的是在统计的发病叶片中病害最高等级。感病性的等级划分：-，病情指数=0；+，病情指数<20; ++，病情指数=20～50；+++，病情指数>50。

2 结果与分析

根据邓秀新等[24]和周开隆等[25]的分类方法，将42个柑橘的品种可划分为橘类、温州蜜柑类、杂柑类、甜橙类、酸橙类、金柑类、葡萄柚类、柚类以及柠檬类(表1)。这些品种对柑橘链格孢褐斑病菌孢子侵染的反应如表1和图1所示。

根据表1显示的数据可知，在测定的13个橘类品种中，3个椪柑品种(太田椪柑、新生系3号椪柑和岩溪晚芦)均高度感病；红橘418、杨小2-6南丰蜜橘、乳橘、无核早橘、瓯柑和满头红也高度感病；然而，少核本地早、朱红和砂糖橘在几次接种中均不发病，表现免疫，克里曼丁(阿)表现中度感病。温州蜜柑(C.unshiu)是我国广泛种植的宽皮柑橘。从表1中可见，伴野易感病，尾张、宫川、山田表现为中等感病，品种青岛轻度感病，而大分1号表现出对该病害的抗性。在杂柑类中，明尼奥拉、奥尔兰多以及诺瓦橘对于褐斑病高度感病，卡拉橘、濑户香、天草、津之香、默科特也同样高度感病。但大谷伊予柑、西之香是轻微感病的，爱伦达尔、红玉柑、清见、不知火以及南香则高度抗病(免疫)。常山胡柚(C.paradisecv. Changshanhuyou)是浙江衢州常山县等地栽培的，类似葡萄柚的一个柑橘品种，在本次试验中也表现感病(表1)。两种金柑类(Fortunellasp.)三山和八字桥对于该病害也高度感病。在测试的两种橙品种中，锦橙78-1轻微感病，待旦夏橙免疫。酸橙类(C.aurantium)中的小红橙、柚类(C.grandis)中的玉环柚、柠檬(C.limon)中的尤力克柠檬，对于褐斑病均表现为高度抗病(表1)。

通过Excel软件对菌株D1在2013年和2014年感病程度进行相关性分析后，其相关系数达到0.963 2，因此认为不同年份间试验结果趋势基本一致。不同柑橘品种对3个不同寄主来源，在系统进化分析中分属不同遗传分支的3个褐斑病菌菌株的反应也基本一致。

3 讨论

柑橘对链格孢褐斑病的抗性是由单个隐性基因控制的[26]，利用病菌孢子悬浮液或菌丝碟接种离体叶片或幼梢评价不同柑橘品种或杂交后代对链格孢褐斑病的抗性是国际上常用的快速抗性评价法[18，22]。本文利用该方法评价了42个常见的柑橘品种对源自国内的菌株的抗性，明确椪柑、红橘、瓯柑、贡柑、天草和默科特是高度感病的品种，这一结果与自然条件发现的褐斑病已在这些品种上流行的结果一致[13-17，27-28]。因此认为在种植这些品种时需要十分小心，不要从发病区引进带病苗木，以免褐斑病的流行。同时还应加强对褐斑病发生的监测，及时防治。我们的研究发现，本地早、朱红橘、砂糖橘、红玉柑、南香、不知火和清见，以及甜橙、柚和柠檬对于褐斑病高抗或免疫。因此，在褐斑病流行猖獗、难以控制的地区，可考虑使用这些品种为替代品种。此外认为这些品种还可以作为抗褐斑病育种的抗源。

阳廷密等[27]在开展广西柑橘主栽品种对褐斑病的抗性鉴定中发现79-2椪柑对褐斑病免疫，而我们的研究中却发现3个椪柑品种均为高感(表1)。椪柑自然条件下发生褐斑病在云南瑞丽、湖南吉首和浙江丽水均观察到(作者亲历果园)，虽然病害发生不及瓯柑和红橘严重，但在瑞丽和吉首，该病害已是生产中的一个问题[15-16，20]。因此，生产上还需加强对椪柑褐斑病发生的监测。

离体条件下人工接种评价温州蜜柑对褐斑病的抗性的结果在不同研究者的研究结果中并不一致。如Vicent等[18]利用来自西班牙的菌株接种温州蜜柑结果是抗病或轻微感病，Solel等[22]利用以色列的菌株接种结果是感病的，阳廷密等[27]所接种的温州蜜柑兴津和日南1号是免疫的。在本研究中6种温州蜜柑中的5种对于中国菌株是感病或轻微感病(表1)。柑橘品种对人工接种的反应不同的原因可能是各研究者所使用的寄主虽然同是温州蜜柑，但遗传背景并不一致，也可能是菌株间的致病性存在差异所致。不过，据我们近几年的田间观察，与瓯柑同处一个果园的温州蜜柑并没发病，由此推测，褐斑病在温州蜜柑上流行的风险不大。

表1 不同柑橘品种对链格孢褐斑病的感病性离体评价

Table 1Invitrosusceptibility evaluation of citrus cultivars toAlternariaalternatapv.citri

柑橘品种病斑形成2013年D12014年D12014年Z52014年H20橘类C.reticulata太田椪柑++++++++++++新生系3号椪柑++++++++++++岩溪晚芦++++++++++++红橘418++++++++++++克里曼丁(阿)+++++++++杨小2-6南丰蜜橘++++++++++++乳橘++++++++++++无核早橘+++++++++++瓯柑++++++++++++满头红++++++++++++少核本地早(东江)----朱红----砂糖橘----柑类Satsuma(C.unshiu)伴野++++++++++++尾张++++++++宫川++++++++青岛++++山田++++++大分1号----甜橙类C.sinensis锦橙78-1+++++待旦夏橙----酸橙类C.aurantium小红橙----柚类C.grandis玉环柚----葡萄柚类C.paradis胡柚++++++++金柑类Fortunella.sp.三山金柑++++++++++++八字桥++++++++++++柠檬类C.limon尤力克柠檬----杂柑类 橘橙(C.reticulata×C.sinensis)爱伦达尔----默科特++++++++++++ 新本1号×刘本橙红玉柑---- 橘橙(C.paradisi×C.reticulata)大谷伊予柑+++++ 橘橙(C.clementina×C.unshiu) 三保温州蜜柑×克里曼丁南香---- 橘橙(C.unshiu×C.reticulata) 清见×中野3号不知火---- 橘橙(C.unshiu×C.sinensis) 特洛维它甜橙×宫川清见----西之香+++++ 橘橙(其他) (清见×兴津)×佩奇橘象山红(天草)+++++++++ 清见×兴津津之香+++++++++ 橘柚(C.paradisi×C.reticulata) 邓肯葡萄柚×丹西红橘明尼奥拉橘柚++++++++++++ 邓肯葡萄柚×丹西红橘奥尔兰多橘柚++++++++ 橘柚(其他) 克里曼丁橘×奥尔兰多橘柚诺瓦橘++++++++++++ 其他杂柑 (清见×恩科)×默科特濑户香+++++++++++ 尾张×王柑卡拉橘++++++++++++

A—D， 蘸孢子悬浮液(105 mL-1)的滤纸片接种(2013年)； E—H， 孢子悬浮液(105 mL-1)喷雾接种(2014年)。 A， B， E， F， 抗病品种红玉柑； C， D， G， H， 感病品种岩溪晚芦。图1 柑橘品种对链格孢褐斑病的感病性离体评价(72 h)Fig.1 In vitro susceptibility evaluation of citrus cultivars to Alternaria alternata pv. citri(72 h)

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(责任编辑 张 韵)

In vitro susceptibility evaluation of citrus cultivars to Alternaria alternata pv. citri

FU Yu-shi1， LUO Jun-qin2， XU Jian-guo2， LI Hong-ye1，*

(1.InstituteofBiotechnology，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China; 2.ZhejiangCitrusResearchInstitute，Taizhou318020，China)

Alternariabrown spot (Alternariaalternatapv.citri) is a highly destructive disease of tangerines and hybrids of tangerine and grapefruit， or tangerine and orange， which causes defoliation， fruit dropping and dieback， and reduces fruit marketability due to the lesions on the fruit surface. In this paper， the susceptibility of 42 citrus cultivars to this disease were evaluated through inoculating the conidia suspension ofA.alternatapv.citrionto the detached young leaves. The result showed that tangerines (Oota ponkan， Xinshengxi No.3 ponkan， Yanxiwanlu ponkan， Hongju 418， Yang xiao 2-6 Nanfengmiju， Ruju， Wuhe Zaoju， Ougan and Mantouhong) were highly susceptible to this pathogen， while Dongjiang Bendizao， Zhuhong and Shatangju showed immunity. Hybrids (Minneola， Orlando， Nova， Kara， Sedoka， Amakusa， Tsunokaori and Murcott) were highly susceptible toA.alternatapv.citri， while Otani-iyo and Nishinoka were slightly susceptible and Ellendale， Hongyugan， Kiyomi， Shiranui and Nankou were immune. Orange， pummelo and lemon were immune to this disease. The susceptibility of other cultivars such as Satsuma， Changshanhuyou and Kumquat remains to be further determined.

citrus cultivars;Alternariabrown spot of citrus; susceptibility;invitroevaluation

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.15

2015-06-29

浙江公益性技术应用研究计划(2012C22100)；现代农业(柑橘)产业技术体系建设专项资金(CAR-27)；公益性行业科研专项(201303023)

符雨诗(1990—)，女，浙江台州人，硕士研究生，研究方向为柑橘褐斑病等。E-mail: fuyushi@163.com

*通信作者，李红叶，E-mail: hyli@zju.edu.cn

S436.66

A

1004-1524(2016)01-0084-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):84-89

符雨诗， 罗君琴， 徐建国，等. 不同柑橘品种对链格孢褐斑病的感病性离体评价[J].浙江农业学报，2016，28(1)：84-89.