环介导等温扩增技术及其在食品检测中的应用

◎卞 璐，张 旭

（1.辽宁省农业经济学校，辽宁 锦州 121001；

2.沈阳铁路局锦州机务段，辽宁 锦州 121001）

环介导等温扩增技术及其在食品检测中的应用

◎卞 璐1，张 旭2

（1.辽宁省农业经济学校，辽宁 锦州 121001；

2.沈阳铁路局锦州机务段，辽宁 锦州 121001）

环介导等温扩增技术是一种具有特异性强、操作简便、快速、高效扩增等优点的等温核酸扩增方法，可在数十分钟内完成，通过使用链替换核酸聚合酶。基于此，就环介导等温扩增技术的原理及其在食源性病原微生物的检测和食品的转基因成分检测方面做一综述。

环介导等温扩增技术；食品；检测

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由日本荣研株式会的Notomi T.等首次报道的一种新的核酸扩增方法，不仅能快速扩增DNA，也可实现对RNA的直接扩增[1]。LAMP技术已经在核酸研究、病原微生物的检测、疾病的诊断和预防、动物的早期胚胎性别鉴定等生命科学领域得到了广泛应用，并取得了一些成就[2-6]。近年来，该技术也逐步被应用到食品检测中来。该文就LAMP技术的原理及其在食品检测即食源性病原微生物的检测和食品的转基因成分检测方面做一综述。

1　LAMP技术原理

双链DNA在65 ℃左右处于动态平衡状态，任何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基互补配对延伸的时候，另一条链就会脱落变成单链，LAMP方法就是利用DNA的这一特点设计而成的。

1.1LAMP技术的引物设计

LAMP方法的4个引物是针对靶基因上的6个区域进行设计的，这6个区域分别是位于3'端的F3c区段，F2c区段、F1c区段和位于5'端的B1区段、B2区段、B3区段（见图1）。LAMP法的2条内引物FIP（Forward Inner Primer）和BIP（Back Inner Primer），FIP包含有F1c序列、TTTT连接子和F2（F2c的互补序列）；BIP包含有B1c（B1的互补序列）、TTTT连接子和B2序列；2条外引物为F3（F3c的互补序列）和B3序列（B3c的互补序列）（见图1）[7]。LAMP引物设计除了要避免引物二聚体形成、3′端发夹结构、引物自身互补等原则外，对引物之间的距离也有要求，F3和F2之间，B2和B3之间的距离应该是0～20 bp，引物中形成环的部分距离是40～60 bp，LAMP反应扩增的区域的距离建议是120～180 bp[8]。

图1　靶序列上6个特异区及引物设计图

1.2LAMP技术的操作程序

LAMP等温扩增反应体系通常为25 μ L，包含了模板DNA、引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。其中内引物浓度为0.8～2.0 μ mol/L，外引物浓度为0.2～0.8 μ mol/L，镁离子浓度为2～10 mmol/L。各种物质混匀后，置于在60～65 ℃保温60～90 min，80 ℃灭活10 min，产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，同时用肉眼观察反应体系的浊度变化[9，10]。

2　LAMP技术在食品检测领域的应用

目前，LAMP技术在食品检测领域的应用主要集中在食源性病原微生物的检测和食品的转基因成分检测两个方面[11-13]。

2.1食源性病原微生物的检测

LAMP技术在食源性致病菌、食源性病毒[14]及食源性寄生虫[15]的检测方面均有研究，但目前报道最多的是食源性致病菌的检测。董鑫悦等以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因，建立了一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明，LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL，其灵敏度是PCR方法的10倍，人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101cfu/mL，具有特异性强、灵敏度高、耗时短的特点[16]。程晓艳等根据副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列设计引物，建立了LAMP快速检测技术，其细菌DNA最低检出限为35.5 fg/反应管，并利用该方法对扇贝样品中致病性副溶血弧菌进行了检测，证明LAMP技术可用于水产品致病菌的快速检测，且操作简单、安全可靠[17]。

2.2食品的转基因成分检测

自世界上首例转基因烟草1983年在美国问世以来[18]，转基因作物的种类与日俱增，其中转基因大豆占全球种植面积的51%，玉米占31%，棉花占13%，油菜占5%[19]。而随着这些转基因产品大量流入市场，其安全性问题已成为全球争论的热点。目前应用的转基因产品的检测方法操作步骤烦琐、检测成本高、时间长，不适合现场实时监测和跟踪检测。LAMP技术作为一种新兴的检测技术，具有操作简单、无须PCR仪和昂贵的试剂、可快速高效扩增等优点，已逐步应用于食品转基因成分的检测分析。我国近年来开展了食品中转基因成分的LAMP检测方法的研究。吴少云等针对转基因水稻Bt63品系外源基因与内源基因结合处序列设计4条特异性引物，建立的实时浊度法LAMP快速检测技术，能够特异性检测转基因水稻Bt63品系，其最低检出限为0.01%，是普通PCR方法的10倍[20]。

总之，作为一种新兴的检测技术，LAMP技术既符合食品临床检验所需的要求，也存在着某些不足。随着LAMP技术的不断发展和改良，LAMP作为一种新兴的检测技术，必将会凭借其强大的优势，在基层检测机构和食品检测部门得到应用和推广。而该技术在食品检测领域的应用和推广，对于提高食品卫生水平、保证食品安全和推动食品国际贸易发展无疑具有重要的意义。

[1] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al．Loopmediated isothermal amplification of DNA[J]．Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

[2]陈伯祥，杨 明，常 亮，等.环介导等温扩增技术在动物传染病诊断中的应用进展[J].动物医学进展，2012，33（4）：90-96.

[3]李 鹏，马艳娇，于 剑，等．猪肺炎支原体环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国生物制品学杂志，2011，24（4）：480-483.

[4]向智龙，卓建华，鲜思美，等．羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2011，41（6）：588-592.

[5]高德臣.环介导等温扩增技术在病原检测中的应用[J].中国畜牧兽医，2012，39（2）：219-221.

[6]肖海霞.应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2006.

[7] Wang L，Shi L，Alam M J，et al. Special and rapid detection of foodborne Salmonella by loop-mediated isothermal amplification method[J]. Food Research International，2008，41（1）：69-74.

[8]张耀祺.环介导等温扩增法快速检测食物中的单增李斯特菌[D].广州：华南理工大学，2012.

[9]彭涛，朱钦昌，王玉涛，等.核酸等温扩增技术及其应用[M].北京：科学出版社，2009：5-12.

[10]Gunimaladevi I，Kono T，Lapatra S E，et al. A loop mediated isothermal amplification （LAMP）method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV）in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）[J]. Arch Virol，2005，150（5）：899-909.

[11]王华，王君玮，徐天刚，等．非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立[J].中国兽医科学，2010，40（9）：940-944．

[12]赵彦宗，张显浩，余小利，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立[J].中国畜牧兽医，2009，36（12）：53-56.

[13]鲜思美，韦洪才，尹强军，等.鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用[J].生物技术通报，2012，27（11）：150-154.

[14]Parida M M，Santhosh S R，Dash P K，et al. Rapid and real-time detection of Chikungunya virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Journal of Clinical Microbiology，2007，45（2）：351-357.

[15]Fukuda S，Takao S，Kuwayama M，et al. Rapid detection of norovirus from fecal specimens by Realtime Reverse Transcription-loop-mediated Isothermal Amplification assay[J]. Journal of Clinical Microbiology，2006，44（4）：1376-1381.

[16]董鑫悦，满朝新，卢 雁，等.环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌[J].食品工业科技，2013，35（5）：318-320，357.

[17]程晓艳，刘庆慧，黄 倢.副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术的建立[J].中国食品学报，2012，12（8）：156-162.

[18] Zambryski P，Joos H，Genetello C，et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneratmn capacity[J]. The EMBO Journal，1983，2（12）：2-143.

[19]王 永，兰青阔，赵 新，等.转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J].中国农业科学，2009，42（4）：1473-1477.

[20]吴少云，唐大运，李 琳，等.LAMP实时浊度法检测转基因水稻Bt63品系[J].食品与机械，2012，28（5）：79-82.

Loop-mediated Isothermal Amplification Technololy and Its Application in Food Detection

Bian Lu1， Zhang Xu2
（1.Liaoning Agricultural Economy School， Jinzhou 121001， China；
2. Shenyang Railway Bureau Jinzhou， Jinzhou 121001， China）

Loop-mediated isothermal amplification technology is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with strong specificity， simple operation， fast and efficient amplification etc， which can complete in dozens of minutes by using Chain replacement DNA polymerase. In this paper， the principle of loop-mediated isothermal amplification technology and its application in detection of the food borne pathogenic microorganism and geneticallymodifiedingredients in food were reviewed.

Loop-mediated isothermal amplification； Food； Detection

Q817

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.06.014