米曲霉A-F04的β-果糖基转移酶基因的克隆鉴定及其生物信息学分析

高　斌,李　棒,李　娅,李　斌,刘成梅,付桂明,*

(1.南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学,中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大学食品学院,江西南昌330031)



米曲霉A-F04的β-果糖基转移酶基因的克隆鉴定及其生物信息学分析

高斌1,2,3,李棒3,李娅3,李斌1,2,3,刘成梅1,2,3,付桂明1,2,3,*

(1.南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学,中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大学食品学院,江西南昌330031)

以实验室前期筛选出的高产β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase)的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株A-F04出发,提取米曲霉A-F04基因组DNA和RNA,采用PCR和RT-PCR技术克隆β-FTase基因,得到β-FTase基因完整编码序列和内含子序列,利用重组技术构建β-果糖基转移酶质粒基因库,并构建基因的进化树,预测β-FTase分子量、等电点、氨基酸组成等物化性质,预测其N-糖基化位点和信号肽,运用SWISS-MODEL对β-FTase的三级结构预测。结果显示,成功鉴定出菌株A-F04具有β-FTase基因;菌株A-F04的β-FTase基因编码区长度为1630 bp,含有一个52 bp的内含子,位于173 bp与224 bp之间;编码序列的开放阅读框总长为1578 bp;软件分析得知β-FTase为亲水性的稳定蛋白,其分子量为57.4653 ku,理论等电点为4.83,由525个氨基酸组成;可能的N-糖基化位点有6处;信号肽分析软件得知其编码的1～17位置处的氨基酸为信号肽;SWISS-MODEL构建的3个模型质量较高,有利于后期对β-FTase的结构和功能的研究。

米曲霉A-F04,β-果糖基转移酶,基因鉴定,生物信息学分析

β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase,EC 2.4.1.9)能以蔗糖为反应底物,催化合成低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)[1-2]。FOS对改善肠道功能、防治便秘和腹泻、提高免疫力、促进矿物质吸收等具有特殊的生理功效,在食品、医药等领域应用市场巨大。在自然条件下,主要从植物中获取FOS,此种方法较为困难,且产量少,工业上主要用β-FTase酶来催化合成FOS[3-7]。

经研究发现,含有β-FTase基因的微生物包括黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、青霉属(Penicillium)及屈芽短梗菌(Aureobasidiumpullulans)等,其中米曲霉分泌和表达β-FTase能力较强,且具有极高的食品安全性,被美国FDA 认证为GRAS的菌种之一。2005年日本科学家[8]完成了米曲霉基因组测序工作,这为基因工程选育米曲霉β-FTase高效表达菌株奠定了基础。目前,对米曲霉的β-FTase基因研究已成为国内外热点。王玉海[9]等把一株原始米曲霉菌株的β-FTase基因进行了克隆并进行了外源表达,对于米曲霉的β-FTase基因尚未进行信号肽、N-糖基化位点等生物信息分析;国外对米曲霉产β-FTase的研究主要集中在发酵条件优化方面[10],在生物信息学分析和外源表达方面较少。本实验以前期筛选出的高产β-FTase的米曲霉A-F04为出发菌株,采用PCR和RT-PCR技术克隆[11]出β-FTase的基因,通过基因测序手段和DNA man软件分析获取得到β-FTase的DNA序列、RNA序列和内含子序列。以此为基础,对β-FTase基因的生物信息学进行分析,探究信号肽位置、构建生物进化树,预测其蛋白质的物化性质、蛋白质跨膜结构区域,并进行氨基酸疏水性分析和同源模型的构建。以期为深入研究米曲霉A-F04表达β-FTase及其原核或真核的外源表达奠定良好的基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

米曲霉(Aspergillusoryzae)A-F04南昌大学食品科学与技术国家重点实验室保藏;大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α(含pPIC9K质粒)中山大学赠送;大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α南昌大学中德食品工程中心保藏;PDA培养基马铃薯200 g,加800 mL蒸馏水煮沸后双层纱布过滤,取滤液,葡萄糖20 g,固体另加1.5%(m/v)的琼脂,蒸馏水定容至1 L,自然pH;发酵优化培养基酵母粉1.5 g,(NH4)2SO41.5 g,蔗糖4 g,NaCl 2 g,固体另加1.5%(m/v)的琼脂,蒸馏水定容至1 L,pH7.0;LB培养基酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,固体另加1.5%(m/v)的琼脂,蒸馏水定容至1 L,pH调至7.0;酵母粉阿拉丁试剂,BR纯度;琼脂粉上海山浦,BR纯度;胰蛋白胨北京奥博星;乳酸石炭酸棉蓝染色液北京百浩;PCR产物柱纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker、SnabⅠ和NotⅠ限制性内切酶大连Takara宝生物;AGAROSE G-10法国Biowest;GoldView北京博凌科为;T4DNA连接酶NEB;RNase酶、RNA提取试剂盒(批号DP432)和cDNA第一链合成试剂盒(批号M1125)、氨苄青霉素北京天根;(NH4)2SO4、氯化钠、蔗糖、NaCl、SDS等国产分析纯。

BA410光学显微镜Phenix;HWS-250型恒温恒湿培养箱上海森信实验仪器有限公司;ZDX-35BI型座式蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;ZHWY-2102C型恒温培养振荡器上海智诚分析仪器制造有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂;2720 Thermal Cycler美国应用生物系统公司;Thermo cell Cooling & Heating Block杭州博日科技有限公司;DYY-8C型电泳仪、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽北京市六一仪器厂;TGL-16B型高速离心机、NanaDrop 2000超微量分光光度计美国热电;凝胶成像系统美国Bio-rad公司。

1.2实验方法

1.2.1菌株A-F04形态学鉴定取用PDA斜面保藏的菌株A-F04在35 ℃(通过实验室前期探究,在此温度下米曲霉A-F04生长速度适宜和菌丝体均匀)活化2～3 h后,在发酵优化培养基平板上划线,35 ℃,恒温恒湿培养2～7 d,观察菌株A-F04菌落、孢子菌丝体形态,35 ℃，200 r/min进行摇瓶发酵培养,观察米曲霉A-F04菌球。挑取单菌落孢子,乳酸石炭酸棉蓝染色液染色后制片,进行镜检。

1.2.2菌株A-F04的β-FTase基因鉴定

1.2.2.1孢子悬浮液制备配制固态发酵优化培养基于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min,分装试管冷却后制成斜面备用。用接种环接种菌株A-F04孢子,斜面划线,35 ℃恒温恒湿静置培养72 h后,用灭菌生理盐水洗脱斜面,制备菌株A-F04的孢子悬浮液,孢子悬浮液倒入100 mL含有灭菌玻璃珠的三角瓶中,充分摇匀后用血球计数板计数。

1.2.2.2米曲霉基因组提取、纯化及质量鉴定接种1%的米曲霉A-F04孢子悬浮液于液体发酵优化培养基中,在35 ℃,200 r/min培养96 h后,无菌条件下真空抽滤获取菌丝体,液氮预冷研磨。米曲霉基因组的DNA提取采用SDS法;总RNA提取方法参照TIANGEN公司总RNA提取试剂盒步骤;参照TIANGEN公司反转录试剂盒合成cDNA。用NanaDrop 2000超微量分光光度计对提取的米曲霉菌株A-F04的DNA和RNA进行检测,DNA和RNA样品的A260/A280比值在1.8～2.0之间,则表示样品中蛋白和酚类物质污染少,DNA和RNA样品的A260/A230比值大于2.0,则表明样品中碳水化物和盐物质污染少,提取的DNA和RNA较纯净,达到PCR扩增研究要求[12]。

随着幼儿年龄的不断增长，其阅读的书籍也会随之深入和量增，通过阅读不同的书籍，从而产生不同的阅读兴趣，实现幼儿全面发展能力的提高。因此，综上所述，在学生幼儿时期，运用恰当的实践策略培养幼儿良好的阅读习惯对于促进幼儿各方面发展来说，具有重要的意义。

电泳压力设定为100 V,电泳时间为35 min,采用1.2 %琼脂糖凝胶[12]对核酸样品进行电泳,电泳结束后用凝胶成像系统对电泳条带进行分析。

1.2.2.3引物的设计与合成根据GenBank公布的米曲霉AspergillusoryzaeN74[13]生物合成β-果糖基转移酶的基因序列(登录号:GU145136),可知,β-FTase编码区基因包括两端的2个外显子和中间的1个内含子,结合质粒pPIC9K的酶切位点和引物设计原则,分析设计了1对特异性扩增引物和1对AOX1基因的通用引物,引物的序列、酶切位点(SnabⅠ和NotⅠ)和保护碱基如表1(引物交由华大基因科技服务有限公司合成)。

表1　PCR扩增引物

表2　PCR反应体系和扩增条件

1.2.2.4编码区和编码序列的克隆对于编码区序列,以基因组DNA为模板,P1和P2为引物进行PCR;对于编码序列,以基因组RNA反转录所得的cDNA为模板,P1和P2为引物进行PCR。其PCR反应体系和扩增条件见表2。PCR产物送至华大基因反复测序,得到编码区序列和编码序列。运用DNA man软件,测序结果与NCBI公布的米曲霉N74β-FTase基因序列进行BLAST比对,进行同源和差异性分析。

1.2.2.5米曲霉A-F04的β-FTase的载体基因库的构建为方便后续对β-FTase基因的研究,柱纯化编码序列的PCR产物,提取大肠杆菌DH5α-pPIC9K的质粒pPIC9K,用SnabⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切后分别进行电泳。用琼脂糖回收试剂盒对电泳条带进行切胶回收纯化,纯化后分别用NanaDrop 2000超微量分光光度计检测酶切后的pPIC9K和PCR产物的量,按照PCR产物量(mol)∶pPIC9K量(mol)=3∶1～6∶1配制酶连反应体系。制备大肠杆菌DH5α感受态[12],将连接产物进行大肠杆菌DH5α转化。使用氨苄青霉素抗性培养,筛选阳性基因库克隆子DH5α(pPIC9K-FTase),阳性克隆子DH5α(pPIC9K-FTase)用5′AOX1和3′AOX1通用引物进行菌液PCR进一步验证,电泳条带切胶回收后送至华大基因反复测序进行最终确认。

1.2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息学分析在NCBI里检索β-FTase基因序列,运用MEGA 5.10工具对来源不同的菌种的β-FTase蛋白进行同源性分析,构建进化树。根据菌株 A-F04的β-FTase测序结果,运用ExPASy中的ProtParam tool分析蛋白质的物理化学性质,分析预测其分子量、理论等电点、氨基酸组成、带正负电荷的残基数、分子元素和不稳定系数。运用美国CBS的TMHMM Server v. 2.0预测并分析蛋白质跨膜结构区域。运用ExPASy的ProtScale工具对β-FTase氨基酸序列进行疏水性分析。运用Signal P对β-FTase信号肽进行预测和分析。运用NetNGlyc 1.0 Server对Β-FTase进行N-糖基化预测。运用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL进行β-FTase三级结构预测。

2　结果与分析

2.1菌株A-F04形态学分析

菌株A-F04斜面培养初期1～2 d呈浅黄色,第3 d菌丝呈黄绿色,继续培养菌体将逐渐变为深绿色,取培养了72 h的菌株A-F04示例,其斜面孢子形态如图1A。对培养72 h的菌株A-F04孢子进行冲洗,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色后制片,进行镜检,1000倍显微镜下可清晰地分辨出分生孢子、顶囊、分生孢子梗和足细胞等曲霉属结构,如图1B。摇瓶发酵培养菌株A-F04,菌球大小均在0.1～2.0 cm之间,其菌球形态如图1C所示,菌球表面有米曲霉特征的刺突结构。

图1　A-F04菌体形态Fig.1　Morphology of A.oryzae A-F04注:A斜面孢子丝;B染色的孢子丝;C摇瓶培养菌球。

图4　编码序列PCR产物测序结果与A.oryzae N74 FTase序列对比Fig.4　Comparison of CDS PCR products and A.oryzae N74 FTase sequence

2.2.1DNA和RNA质量鉴定用NanaDrop 2000检测DNA和RNA样品,结果显示菌株A-F04的DNA样品浓度为(543.1±3.4) ng/μL,RNA样品浓度(127.9±1.7) ng/μL,A260/A280在1.8～2.0之间,A260/A230大于2.0,达到PCR扩增研究要求。对总RNA进行电泳,如图2所示,泳道1条带清晰明亮,28 S条带亮度为18 S条带亮度的2倍左右,可知RNA质量良好。以此总RNA为模板,合成cDNA文库,步骤参照cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。

图2　菌株A-F04总RNA电泳图Fig.2　Agarose gel electrophoresis of A.oryzae A-F04 RNA

2.2.2编码区和编码序列的克隆分析以菌株A-F04的DNA和cDNA为模板,P1和P2为引物进行PCR,克隆β-FTase的编码区和编码序列,电泳结果如图3所示。泳道2为以DNA为模板的β-FTase基因编码区的条带,泳道1是以cDNA为模板的β-FTase基因编码序列条带,泳道2处条带约1630 bp,泳道1处条带约为1578 bp,符合预期。

图3　菌株A-F04的β-FTase基因PCR产物电泳图Fig.3　β-FTase gene PCR products from A-F04 strain注:泳道1为以cDNA为模板β-FTase基因的PCR产物,泳道2为以DNA为模板PCR产物。

2.2.3PCR产物测序和BLAST比对鉴定取编码区和编码序列的PCR产物,根据华大基因反馈的测序结果,减去引物和保护碱基的长度即为米曲霉β-FTase基因的长度。对比DNA和cDNA的PCR产物的长度,可知米曲霉A-F04的编码区长度为1630 bp,编码序列长度为1578 bp,在位置为173～224 bp之间含有一个长度为52 bp的内含子,将其序列与AspergillusOryzaeN74 FTase 的mRNA序列进行BLAST比对,如图4,分析可知其同源性为100%,未发现碱基突变,成功鉴定本实验中米曲霉A-F04菌株具有β-FTase基因。

2.2.4pPIC9K-β-FTase载体基因库的构建SnabⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切质粒pPIC9K和纯化后的编码序列PCR产物,电泳如图5所示,图5-A泳道1为双酶切后的质粒pPIC9K,大小为9000 bp左右,符合预期,图5-B泳道1为双酶切后的编码序列PCR产物,大小为1570 bp左右,符合预期。

图5　质粒pPIC9K双酶切(A)及编码序列PCR产物双酶切(B)Fig.5　Electrophoretogram of pPIC9K after double enzyme digestion(A),Electrophoretogram of PCR product after double enzyme digestion(B)

用T4DNA连接酶并成功转入至大肠杆菌DH5α,在含有氨苄青霉素抗性的LB培养基培养筛选,用5′AOX1和3′AOX1通用引物进行阳性重组子菌液PCR初步验证,进行电泳,如图6所示,泳道1条带为1900 bp左右,符合预期。

图6　重组菌菌液PCR验证电泳Fig.6　Electrophoretogram of recombinantE.coli-pPIC9K-FTase PCR products

提取重组菌的质粒,用SnabⅠ和NotⅠ酶进行双酶切,酶切后进行电泳,如图7所示,条带有2条,分别在9000 bp和1570 bp左右位置,符合质粒pPIC9K-FTase的大小要求,进一步验证了重组菌为阳性。

图7　重组质粒pPIC9K-FTase双酶切验证Fig.7　Double enzymes digestion of recombinant plasmid pPIC9K-FTase

PCR菌液测序所得的序列与FTase基因在DNA man软件上比对结果显示一致,最终确认pPIC9K-FTase载体基因库构建成功。

2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息学分析

2.3.1同源进化树分析在NCBI检索到产FTase菌有放线菌(Actinomycesnaeslundii)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、曲霉(AspergillusruberCBS135680)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、Phleumpratense、酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)和链球菌(Streptococcusmutans)等。运用MEGA 5.10进行这些菌的同源性分析和进化树构建,如图8所示,米曲霉的β-FTase基因在进化树上的位置处于酵母菌和细菌的β-FTase基因之间,合成β-FTase的米曲霉与同属曲霉的红曲霉亲源较近,与酵母菌次之。除了以上微生物具有β-FTase基因,其他合成β-FTase的物种均属于植物。

图8　产β-FTase菌系同源性和统进化树Fig.8　Homology and phylogenetic tree of β-FTase-producing strains

2.3.2物化性质预测分析运用ExPASy 中的ProtParam tool工具预测β-FTase理化性质,可知β-FTase分子量为57.4653 ku,理论等电点为4.83,由525个氨基酸组成(6.9% Ala、6.9% Arg、5.1% Asn、6.3% Asp、0.2% Cys、3.8% Gln、4.0% Glu、8.8% Gly、2.5% His、3.8% Ile、5.7% Leu、3.2% Lys、1.0% Met、6.9% Phe、5.9% Pro、10.7% Ser、8.4% Thr、2.5% Trp、4.0% Tyr、7.8% Val),带正电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)数为54个,带负电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)数为31个。FTase分子元素组成为C2597H3834N670O802S6,其不稳定指数为34.37,可知FTase为稳定蛋白。

2.3.3结构和性质预测分析运用TMHMM Server v.2.0 分析蛋白序列跨膜区分析得知,FTase是膜外蛋白,没有跨膜结构域。运用ExPASy的ProtScale分析FTase亲疏水性,可知FTase脂溶指数为66.65、总平均亲水性为-0.292,可知FTase为亲水性蛋白。

运用Signal P预测β-FTase的信号肽,如图9所示,1～17位置处的氨基酸S值较高(每个氨基酸对应1个S值,信号肽区域的S值较高);在17位置处的氨基酸C值和Y值最高,可知17位置处氨基酸为信号肽剪切位点。

图9　Signal P对β-FTase信号肽预测Fig.9　Prediction of β-FTase signal peptide

运用NetNGlyc 1.0 Server 对FTase进行N-糖基化预测,结果如图10,可知β-FTase有6处可能性(>0.5)的N-糖基化位点,在氨基酸位置为59和204位置处几率最大,其次是261和399位置处,107和437位置可能性稍弱。

图10　β-FTase N-糖基化位点预测Fig.10　Prediction of β-FTase N-Glycosylation sites

运用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL进行FTase三级结构预测,预测出3种可能性结构,如图11所示,模型A、B和C对应的模板分别是3kf3.1.A、3u75.1.A和3kf5.1.A。模型A对应的GMQE值和QMEAN4值分别为0.68和-7.16,模型B对应的GMQE值和QMEAN4值分别为0.68和-7.15,模型C对应的GMQE值和QMEAN4值分别为0.68和-8.86,构建的3个模型的GMQE(全球性模型质量估测)接近1,QMEAN4值小于0,评估结果表明3个模型立体结构上合理,模型质量较高[14-15]。通过同源模建获得β-FTase的三维结构,有利于研究β-FTase的结构和功能,预测其催化反应的相互作用方式。

图11　SWISS-MODEL同源建模预测β-FTase三级结构Fig.11　Tertiary structure of β-FTaseby homology tool SWISS-MODEL

3　结论

本研究以实验室前期筛选出的高产β-FTase的米曲霉菌株A-F04为基础,对该米曲霉菌株进行了β-FTase基因的克隆鉴定,成功验证出菌株A-F04具有β-FTase的基因。对β-FTase基因进行了克隆,构建了β-FTase的质粒基因库E.coli-pPIC9k-FTase,对β-FTase基因的编码区和编码序列进行了测序,成功获取了β-FTase基因的编码区、编码序列和内含子序列。对菌株A-F04的β-FTase基因的生物信息学分析结果显示,菌株A-F04的β-FTase基因编码区长度为1630 bp,含有一个52 bp的内含子,位于173 bp与224 bp之间;编码序列的开放阅读框总长为1578 bp;软件分析得知β-FTase为亲水性的稳定蛋白,其分子量为57.4653 ku,理论等电点为4.83,由525个氨基酸组成;可能的N-糖基化位点有6处;信号肽分析软件得知其编码的1～17位置处的氨基酸为信号肽;SWISS-MODEL构建的3个模型质量较高。

本文克隆鉴定了菌株A-F04的β-FTase基因,并进行了序列分析及基因的功能预测,为深入研究该基因功能打下了良好的基础。

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Cloning,identification and bioinformatics analysis ofβ-fructosyltransferase fromAspergillusoryzaeA-F04

GAO Bin1,2,3,LI Bang3,LI Ya3,LI Bin1,2,3,LIU Cheng-mei1,2,3,FU Gui-ming1,2,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Food Engineering Center,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Food Science and Technology College,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

Based on the efficient expressingAspergillusoryzaestrain A-F04,the DNA and RNA of strain A-F04 were extracted,PCR and RT-PCR strategies were used to obtainβ-FTase sequences,thus,β-FTase gene bank was constructed. Evolutionary tree was built,and physicochemical property including formula weight,isoelectric point and amino acid composition were predicted,the possible glycosylation sites were predicted. SWISS MODEL tool was used to predictβ-FTase tertiary structure. Experimental results showed thatβ-FTase gene was successfully identified in strain A-F04. Strain A-F04’s coding region was 1630 bp,including an intron,between 173 bp and 224 bp,CDS were 1578 bp. Bioinformatics analysis program analysis showed thatβ-FTase was hydrophilic stable protein,its formula weight was 57.4653 ku,isoelectric point was 4.83,composed by 525 amino acids,within 6 possible glycosylation sites. Signal P program showed that the amino acids at 1 to 17 sites were signal peptide. The tertiary structure model constructed by SWISS-MODEL contributes to theβ-FTase’s structure and function exploration.

AspergillusoryzaeA-F04;β-fructosyltransferase;gene identification;bioinformatics analysis

2015-10-26

高斌(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail:82083790@qq.com。

付桂明(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学、发酵工程研究,E-mail:fuguiming@ncu.edu.cn。

食品与技术国家重点实验室自由探索课题(SKLF-22B-201313)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.035