豆腐柴叶果胶的提取与理化性质分析

张　攀,熊双丽,2,*,薛朝云

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司,四川绵阳 621700)



豆腐柴叶果胶的提取与理化性质分析

张攀1,熊双丽1,2,*,薛朝云3

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司,四川绵阳 621700)

为探究10月份豆腐柴叶果胶含量与品质,优化果胶提取工艺,提升豆腐柴开发利用效率。首先利用单因素实验比较酸提取法和超声波辅助提取法对果胶提取率的影响,再根据Box-Behnken实验设计原理,对酸法提取果胶工艺进行响应面优化,最后对两种提取工艺得到的果胶进行分离和理化性质比较。结果表明,酸提取法较好,最佳工艺条件为:料液比1∶30,提取温度88 ℃,提取时间2.2 h,溶液pH1.6,该条件下果胶提取率为10.57%。紫外光谱和红外光谱发现豆腐柴果胶结构与橘皮果胶结构一致。酸法果胶总半乳糖醛酸含量高于超声波辅助提取法,pH、酯化度与橘皮果胶相似,灰分、钙含量高于橘皮果胶,所有指标均达到了行业标准。

豆腐柴,果胶,提取,理化性质,响应面

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)是马鞭科豆腐柴属多年生落叶灌木,广泛分布于我国华东、华中、中南、西南等省区[1]。豆腐柴中含有大量的果胶、粗纤维、粗蛋白及丰富的矿物质和黄酮类物质[2-3]。用其制成的豆腐,俗称“观音豆腐”或“树叶豆腐”,是安徽省大别山、浙江省浦江县和四川江油一带的特色小吃。

目前,国内外提取果胶的方法主要有酸提取法、酶法、微生物法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、螯合剂提取法等[4-8]。关于豆腐柴的报道主要集中在豆腐制作、果胶提取以及豆腐柴果胶酯化度、胶凝性等理化性质研究,而且原料皆来自华东、华中、华南的安徽、湖北等地,关于四川地区豆腐柴的研究报道很少。报道数据显示每年5～8月豆腐柴果胶提取率较高,为15%～25%,而每年10月份最低,提取率仅为4%左右[9-10]。

不同地区、不同产地、不同季节的豆腐柴的营养成分、果胶含量存在差异,且在实验室以往的研究中发现10月份的豆腐柴做出的豆腐产量不如6～9月份豆腐柴做出的豆腐产量高,但四川江油地区的人们仍然经常使用10月份豆腐柴做“树叶豆腐”。为更好地利用豆腐柴资源,本文采用四川江油地区10月份的豆腐柴叶为原料进行实验,选用酸提取法和超声波辅助提取法两种方法提取豆腐柴叶果胶,并对这两种方法提取的果胶产品进行比较分析。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)采摘于四川绵阳江油豆腐柴基地(江油市春雨生态农业科技有限公司),将鲜叶洗净,置于50 ℃烘箱中烘干、粉碎备用;半乳糖醛酸标准品(≥97%)美国Fluka公司;咔唑、橘皮果胶标品美国Sigma公司;盐酸、浓硫酸、无水乙醇、氢氧化钠、高锰酸钾等均为分析纯。

XMTS-9000电热恒温鼓风干燥箱浙江余姚市工业仪表二厂;HH-S数显恒温水浴锅浙江金坛市正基仪器有限公司;KQ5200B型超声波清洗器江苏昆山市超声仪器有限公司;SF-TDL-550台式低速大容量离心机上海菲恰尔分析仪器有限公司;UV-5800PC紫外可见光分光光度计上海元析仪器有限公司;MODUL YOD-230冷冻干燥机美国Thermo Fisher Scientific公司;U-3900H紫外分光光度计日本日立公司;Frontier红外吸收光谱仪美国Perkinelmer公司。

1.2实验方法

1.2.1酸提取法单因素实验

1.2.1.1料液比对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,在80 ℃水浴锅中提取2.0 h,研究不同料液比对果胶提取率的影响。

1.2.1.2提取温度对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,分别在60、70、80、90、100 ℃水浴锅中提取2.0 h,研究不同提取温度对果胶提取率的影响。

1.2.1.3提取时间对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,在80 ℃水浴锅中分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,研究不同提取时间对果胶提取率的影响。

1.2.1.4溶液pH对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30分别加入已用盐酸将pH调为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的蒸馏水,在80 ℃水浴锅中提取2.0 h,研究不同溶液pH对果胶提取率的影响。

1.2.2超声波辅助提取法单因素实验

1.2.2.1料液比对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,在温度为60 ℃、超声功率为200 W的超声波清洗器中提取60 min,研究不同料液比对果胶提取率的影响。

1.2.2.2提取温度对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,分别在温度为40、50、60、70、80 ℃,超声功率为200 W的超声波清洗器中提取60 min,研究不同提取温度对果胶提取率的影响。

1.2.2.3提取时间对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30加入已用盐酸将pH调为2.0的蒸馏水,在温度为60 ℃、超声功率为200 W的超声波清洗器中分别提取20、40、60、80、100 min,研究不同提取时间对果胶提取率的影响。

1.2.2.4溶液pH对果胶提取率的影响称取豆腐柴粉末1 g,按料液比1∶30分别加入已用盐酸将pH调为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的蒸馏水,在温度为60 ℃、超声功率为200 W的超声波清洗器中提取60 min,研究不同溶液pH对果胶提取率的影响。

1.2.3响应面实验依据1.2.1和1.2.2结果,发现酸提取法效果较好,而且料液比、提取温度、提取时间、溶液pH均对果胶提取率影响较大,故利用Design-Expert 8.0.6软件对酸提取法进行4因素3水平(见表1)的Box-Behnken实验设计。

表1　因素水平编码表

1.2.4果胶含量测定与提取率计算果胶包括原果胶、果胶和果胶酸,其基本结构是以α-1,4-糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸,所以半乳糖醛酸含量能间接反映果胶含量,本文主要以半乳糖醛酸含量反映豆腐柴叶果胶提取率的高低。

1.2.4.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制以半乳糖醛酸质量(x)为横坐标,吸光度(y)为纵坐标,绘制标准曲线[11],得曲线方程为y=0.0050x+0.0029,R2=0.9991。

1.2.4.2提取液果胶含量测定吸取豆腐柴果胶提取液1 mL,用去离子水稀释到适当浓度。取稀释液1 mL,继续按制作标准曲线的方法操作。

1.2.4.3果胶提取率计算由标准曲线方程计算出半乳糖醛酸含量,再根据公式计算出果胶提取率。计算公式[12]:果胶提取率(以半乳糖醛酸含量计,%)=m0×V×K/m×106×100。式中:m0为由标准曲线方程计算出的每毫升稀释液中所含半乳糖醛酸质量,μg;V为果胶提取液总体积,mL;K为果胶提取液稀释倍数;m为称取豆腐柴叶粉末质量,g。

1.2.5果胶分离各称取100 g豆腐柴叶粉末,分别采用酸提取法和超声波辅助提取法最优提取工艺提取果胶,提取后趁热离心(4000 r/min,15 min),弃去滤渣得到果胶提取液,50 ℃真空旋转浓缩至提取液体积减少一半,用浓缩液两倍体积的无水乙醇沉淀,静置6 h后离心(4000 r/min,15 min)得到果胶滤饼,溶解再沉淀6 h后离心(4000 r/min,15 min),将滤饼冷冻真空干燥48 h,取出粉碎得果胶产品,进行理化性质分析。

1.2.6果胶产品理化性质分析

1.2.6.1主要成分分析严格按照QB 2484-2000《食品添加剂 果胶》中的方法测定果胶产品的干燥减重[13]、总半乳糖醛酸[13]、灰分[13]、pH[13],按蒋立科等的方法测定酯化度[14],按照公式[15]甲氧基含量=酯化度×16.3%计算甲氧基含量,严格按GB/T 6436-2002《饲料中钙的测定》中的高锰酸钾法[16]测定Ca含量。

1.2.6.2紫外光谱分析称取0.25 g果胶产品,配制成0.25%的果胶溶液,取适量溶液于石英比色皿中,采用紫外分光光度计在190～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。

1.2.6.3红外光谱分析取2 mg左右的果胶产品粉末,与100 mg左右的溴化钾研磨混合后压片制样,采用红外吸收光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.7数据处理与统计分析所有实验重复4次,取平均值,并计算标准差。利用Microsoft Excel 2013软件进行数据处理和作图,运用SPSS 13.0软件对单因素实验结果进行统计分析,选用LSD最小显著法进行多重比较,通过逐步回归分析法与t检验建立回归关系,并剔除逐步回归过程中线性相关关系不显著的变量,选出对因变量影响大的自变量进行响应面实验。根据Box-Behnken实验设计原理,进行响应面实验,利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行回归分析,选择Quadratic模型并对模型进行方差分析和显著性分析,显著差异均使用5%的显著水平来确定,最终得到优化结果。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1料液比对果胶提取率的影响由图1可以看出,酸提取法果胶提取率略高于超声波辅助提取法。两种提取方法变化趋势一致,均是随着料液比的增大,果胶提取率逐渐增大,当料液比达到1∶30时,提取率增加变得平缓。这可能是因为料液比太小,原料中的果胶提取不完全;但料液比过大,提取液的体积大,果胶浓度较小,增加了后续浓缩、沉淀工艺的难度。所以选择1∶30的料液比较合理。

图1　料液比对果胶提取率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of pectin

2.1.2提取温度对果胶提取率的影响由图2可以看出,温度对酸提取法影响更明显。酸提取法在60～90 ℃范围内,果胶提取率随温度的升高明显增加;但温度超过90 ℃,提取率反而下降,这或许是因为温度过高,破坏了果胶分子的结构,造成果胶的降解,因此选择90 ℃左右的提取温度较合适。而超声波辅助提取法在40～80 ℃整个温度范围内果胶提取率变化不明显,这可能是因为超声波的机械、空化和热效应可以加速细胞的破碎和崩解,使果胶快速水解释放,又因温度在60 ℃时提取率相对较高,所以提取温度选择60 ℃。

图2　提取温度对果胶提取率的影响Fig.2　Effect of extraction temperature on the extraction rate of pectin

2.1.3提取时间对果胶提取率的影响由图3可以看出,酸提取法随着提取时间的延长,果胶提取率有明显的增长;但2.5 h之后,提取率有所下降。这是因为提取时间过短,豆腐柴叶中的果胶物质不能充分溶解在水中,提取液中果胶含量低;但提取时间过长,会造成果胶水解,导致提取率降低,所以提取时间控制在2.5 h为宜。超声波辅助提取法随着提取时间的增长,果胶提取率增加;但80 min之后,果胶提取率有所下降。当果胶提取率在4%左右时,达到相同的提取率,超声波辅助提取法所用的时间要短很多,这是因为超声波的空化效应可以使细胞壁在瞬间破裂,使果胶物质溶出;但提取时间过长,空化效应也会加速果胶分子的裂解,导致果胶提取率下降,效果不如酸提取法,且超声波能耗大。综合考虑,选择提取时间为60 min较合适。

图3　提取时间对果胶提取率的影响Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of pectin

2.1.4溶液pH对果胶提取率的影响由图4可以看出,溶液pH对两种提取方法果胶提取率的影响相似,提取率大小也相差不大。当pH为2.0时果胶提取率最高,pH高于或低于2.0时提取率均会下降。这是因为提取液在一定酸度的情况下,可以使豆腐柴叶中的果胶充分水解释放,pH过高或过低都会降低其水解能力。因此,溶液pH为2.0最合适。

由单因素实验可以看出,酸提取法明显优于超声波辅助提取法,与王媛莉等[10]的研究结果超声波的采用对草酸铵法提取果胶具有较强的辅助作用不同,这可能是因为超声波对不同的提取剂具有不同的影响,其原因有待进一步探讨。

2.2响应面法优化酸提取法

2.2.1响应面实验结果响应面分析方案及实验结果见表2,运用Design-Expert 8.0.6软件对表2中实验数据进行分析得到回归模型方程式(1)、回归模型方差分析表3。其回归模型方程为:果胶提取率(%)=10.31+0.062A+0.45B+0.82C-1.83D-0.88AB-2.23AC-0.047AD-0.69BC-0.40BD+1.81CD-1.54A2-2.39B2-2.16C2-1.48D2

式(1)

表2　响应面分析方案及实验结果

由方差分析表3可知,失拟项F=5.19,p=0.0633>0.05,差异不显著,表明模型拟合度较好;模型F=116.49,p<0.0001,达到了极显著,此时回归方差模型是高度显著的,说明实验误差小,可以用此模型对果胶工艺进行分析和预测。影响方程的因素中A和AD差异不显著,BD差异显著,其余各因素及各因素交互作用的p值均小于0.01,差异均为极显著。根据各因素F值的大小可知,各因素主效应关系为:溶液pH>提取时间>提取温度>料液比。

2.2.2交互作用分析图5直观地反映了酸提取法的影响因素中,将其中任意两个因素固定在零水平,另外两因素对响应值的影响。由图5(a)可知,固定提取时间和溶液pH,果胶提取率随着料液比的增大先增加后下降;当料液比处于低水平时,果胶提取率随着温度的升高先增加后变得平缓,当料液比处于高水平时,果胶提取率随着温度的升高先上升后下降。由图5(b)可知,固定提取温度和溶液pH,当料液比处于低水平时,果胶提取率随着提取时间的增长先增加后变得平缓,当料液比处于高水平时,果胶提取率随着时间的增长先升高后下降;当提取时间处于低水平时,果胶提取率随着料液比的增大明显增加,当时间处于高水平时,果胶提取率随料液比的增大反而下降。可能是因为果胶分子的裂解与提取液中果胶的浓度有关,当提取液中果胶浓度较高时,该体系较稳定,受提取温度和提取时间的影响较小;当提取液中果胶浓度较低时,此时体系不稳定,果胶分子随提取温度的升高和提取时间的延长易分解,导致提取率下降。由图5(c)可知,固定提取温度和提取时间,果胶提取率随着料液比和溶液pH的增大均呈先增加后下降的趋势,但变化趋势比较平缓。由图5(d)可知,固定料液比和溶液pH,果胶提取率随着提取时间和提取温度的增加均呈现先增加后下降的趋势。由图5(e)可知,固定料液比和提取时间,当提取温度处于低水平时,果胶提取率受溶液pH影响不大;当温度处于高水平时,果胶提取率随着溶液pH的增大先增加后下降;当溶液pH一定时,果胶提取率随提取温度的升高先增加后降低。由图5(f)可知,固定料液比和提取温度,当提取时间处于低水平时,果胶提取率受溶液pH的影响较大;当溶液pH一定时,果胶提取率随提取时间的增长先增加后下降。由等高线为椭圆知AB、AC、BC、BD、CD两两交互作用显著,而AD交互作用等高线接近于圆形,说明其交互作用不显著,与上述方差分析结果相符。

表3　回归模型方差分析表

注:**表示差异极显著(p<0.01),*表示差异显著(0.010.05)。

表4　果胶主要成分

注:- 表示标准中未说明。

2.2.3最佳工艺及验证实验根据所得到的模型,运用Design-Expert 8.0.6软件对模型进行分析,预测出酸提取法最佳工艺条件为:料液比1∶30.8,提取温度88.4 ℃,提取时间2.24 h,溶液pH1.58,此时,果胶提取率理论可达10.66%,高于超声波辅助提取法提取率8.96%。考虑到实际操作的便利,将最佳工艺条件调整为:料液比1∶30,提取温度88 ℃,提取时间2.2 h,溶液pH1.6,在此条件下进行4次平行实验,得到果胶提取率平均值为10.57%,与理论预测值基本吻合。说明了回归方程的预测值与实验值之间具有较好的拟合度,因此,由响应面分析所得的优化工艺参数可靠,具有实用价值。

由于本文酸提取法提取率较高,所以只显示和分析了响应面优化酸法提取工艺结果。为分析两种不同工艺条件下果胶产品理化性质,本实验还采用响应面优化了超声波辅助提取法,在超声功率为200 W时其最佳工艺条件为:料液比1∶30,提取温度60 ℃,提取时间60 min,溶液pH1.8,该条件下果胶提取率为8.96%。

2.3果胶产品理化性质分析

2.3.1果胶主要成分分析果胶主要成分如表4所示。

由表4可知:两种提取方法得到的果胶产品其主要成分大体相同,各指标均达到了行业标准。酸提取法果胶总半乳糖醛酸含量高于超声波辅助提取法,这可能是因为超声波的机械效应、空化效应和热效应使半乳糖醛酸分子降解,导致含量偏低。豆腐柴果胶酯化度大于50%,甲氧基含量大于7%,属于高酯果胶,比蒋立科等[14]的研究结果略高,这可能是因为不同地区豆腐柴果胶的酯化度不同。豆腐柴果胶灰分含量较高,可能是含有较多的钙,通过对钙含量的测定也验证了其钙含量确实比橘皮果胶标品高很多。钙离子含量对果胶的胶凝性能有影响,当钙离子含量达到3%时豆腐柴果胶的胶凝性能和粘度最好[17],所以豆腐柴果胶优于橘皮果胶标品。

2.3.2紫外光谱分析两种提取方法得到的豆腐柴果胶和橘皮果胶标品的紫外光谱图见图6。

图5　各因素交互作用对果胶提取率影响的响应曲面图Fig.5　Three-dimension response surface plot of the combined effects of each factor on the extraction rate of pectin

图6　不同方法提取的果胶的紫外光谱图Fig.6　Ultraviolet spectroscopy of pectin from different extraction methods

由图6可知,三种果胶在210～220、260、280 nm处均没有出现吸收峰,说明果胶中没有肽、核酸和蛋白质等物质的存在。橘皮果胶标品可能含有其它杂质,而豆腐柴果胶纯度较高。

2.3.3红外光谱分析两种提取方法得到的豆腐柴果胶和橘皮果胶标品的红外光谱图见图7。

图7　不同方法提取的果胶的红外光谱图Fig.7　Infrared spectroscopy of pectin from different extraction methods

由图7可知,豆腐柴果胶和橘皮果胶标品在400～4000 cm-1范围类具有糖类的特征吸收峰。3433 cm-1附近出现的宽吸收峰是O-H键的伸缩振动;在2929 cm-1附近出现的较弱吸收峰是由C-H键伸缩振动引起的[18];1750 cm-1附近出现的吸收峰是由C=O键伸缩振动引起,说明存在糖醛酸组分[17];1630 cm-1附近的吸收峰是由COOH或-CO-基团的C=O非对称伸缩振动引起的,1443 cm-1处吸收峰是由-COOH的C-O伸缩振动引起的,证明有果胶特征基团羧基的存在;1237 cm-1和832 cm-1附近的吸收峰是S=O键的伸缩振动,说明果胶含有硫酸根[19]。1400～1200 cm-1的吸收峰是由C-H键的变角振动引起的;1200～1000 cm-1的吸收峰是果胶分子中的两种C-O键的变角振动吸收,包括C-O-H和C-O-C键[20-23];966 cm-1附近的吸收峰可能为鼠李糖的特征吸收峰,由鼠李糖的末端脱氧糖-CH2-引起,只有超声波提取的果胶含有该吸收峰;920 cm-1为D-葡萄吡喃糖的C-O-C非对称伸缩振动吸收峰;832 cm-1的吸收峰说明可能存在α-D-葡萄吡喃糖、α-D-半乳吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖或α-D-甘露吡喃糖,763 cm-1附近为α-D-木吡喃糖吸收峰。通过红外光谱图可以看出,两种方法提取的豆腐柴果胶以及橘皮果胶标品的主要特征峰相同,都含有糖醛酸羧基、羟基和硫酸基,进一步验证了所提取的物质为果胶。

3　结论

酸提取法优于超声波辅助提取法。超声波辅助提取法虽然能在一定程度上缩短提取时间,但提取过程中色素也被大量溶出,得到的果胶颜色较深,增加了脱色工艺的难度,并且超声波能耗大,不经济,果胶提取率不如酸提取法,所以采用酸提取法提取豆腐柴果胶更合适。经过单因素实验和响应面法优化得到酸提取法最优工艺条件是:料液比1∶30,提取温度88 ℃,提取时间2.2 h,溶液pH1.6,该条件下果胶提取率为10.57%,影响果胶提取率因素的主次顺序为:溶液pH>提取时间>提取温度>料液比。两种方法提取的果胶产品的干燥减重、灰分、总半乳糖醛酸含量、酯化度、钙含量等常规成分和结构相似。其中钙含量高,钙离子可与果胶发生交联作用,这可能是“树叶豆腐”制作简单、品质好、产率高的原因,其机制有待进一步分析。

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Extraction and physicochemical properties of pectin fromPremnamicrophyllaTurczleaves

ZHANG Pan1,XIONG Shuang-li1,2,*,XUE Chao-yun3

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010,China;3.Jiangyou Chunyu Ecological Agricultural Science and Technology Co.,Ltd.,Mianyang 621700,China)

This paper was to explore the content and quality of pectin fromPremnamicrophyllaTurczleaves in October,optimize the pectin extraction process and enhance the utilization efficiency of it. Firstly,single factor experiments were used to compare the effect of acid extraction method and the ultrasonic assisted extraction on the extraction rate of pectin. Then,according to the Box-Behnken design principle,the extracting process conditions of pectin through the acid extraction method were optimized by Response Surface Methodology(RSM). Finally,the pectins from the two methods were separated before the physicochemical properties of them were compared. The results showed that the acid extraction method was better and the optimum conditions of the acid extraction method were the solid-liquid ratio of 1∶30,the extraction temperature of 88 ℃,the extraction time of 2.2 h,and the pH solution of 1.6. Under above combined condition,the extraction rate of pectin was 10.57%. Ultraviolet and Infrared Spectroscopy indicated that the structures of pectin were similar to that pectin from the orange peel. The total galacturonic acid content of pectin obtained by acid extraction method was higher than that of the ultrasonic assisted extraction method. The value of pH and the degree of esterification of pectin from two methods were similar to that of the pectin from orange peel. The ash content and calcium content were higher than that of orange peel pectin. All the indicators of the pectin products meet industry standard requirements.

PremnamicrophyllaTurcz;pectin;extract;physical and chemical properties;response surface

2016-01-25

张攀(1994-)，女，大学本科在读，研究方向：食品科学与工程，E-mail：zhangpan126@yeah.net。

熊双丽(1977-)，女，博士，教授，研究方向：碳水化合物与生物技术，E-mail:xiongshuangli@swust.edu.cn。

四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心专职科研创新团队建设基金项目(14tdgc04)。

TS202

B

1002-0306(2016)16-0278-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.047