黑枸杞花色苷提取工艺的优化

潘自皓,顾子杨,周　帅,蒋　月,耿思琪,丁　帆,裴昌松,潘　扬,*

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210046;2.苏州大学附属第一医院泌尿外科,江苏苏州 215006)



黑枸杞花色苷提取工艺的优化

潘自皓1,顾子杨1,周帅1,蒋月1,耿思琪1,丁帆1,裴昌松2,*,潘扬1,*

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210046;2.苏州大学附属第一医院泌尿外科,江苏苏州 215006)

以总花色苷含量和DPPH·清除率为评价指标,在考察总花色苷含量测定方法的基础上,对黑枸杞花色苷的提取工艺进行优化。经单因素实验和L9(34)正交实验,选择提取方式为静置法,提取溶剂为1%甲酸,提取温度为75 ℃,料液比为1∶30 g/mL,每次提取时间为1 h和提取次数为3次。优化工艺的总花色苷含量和DPPH·清除率分别达到(450.55±5.91) mg/100 g DW和72.53%±0.60%,相比基础工艺分别提高了17.22%和21.96%。

黑枸杞,花色苷,总花色苷含量,DPPH·清除率

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr.),为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木,其果实味甜多汁,营养丰富,被誉为荒漠中的“软黄金”和“黑珍珠”,极具研究和开发价值。黑枸杞含有极为丰富的花色苷类成分[1],而花色苷又具有显著的抗氧化活性,远强于维生素C和维生素E[2-3],其含有的众多酚羟基能够切断自由基链式反应,从而有效清除活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)[4]。

植物花色苷的提取方式主要是溶剂提取法,受到多种因素的影响,主要包括原料粒径,料液比,提取溶剂种类、浓度与pH,提取温度、时间和次数等。其中,原料粒径和料液比对花色苷提取得率影响显著[5],提取溶剂多数选择弱酸性的甲醇、乙醇、丙酮及其混合溶剂,提取温度不宜太高,提取时间也不宜过长,以避免花色苷类成分发生降解[6-8]。同时,溶剂提取法虽然操作简单,对设备要求较低,但也存在提取效率较低,杂质含量高,提取时间较长与热不稳定成分易被破坏等缺点,故常与辅助提取方法结合使用,以改进提取效果,目前常用的辅助提取方法包括超声、振荡和微波提取法[9-11]。

为开展黑枸杞花色苷的产品开发,本研究以总花色苷含量和DPPH·清除率为指标,考察了不同的工艺参数对提取效果的影响,优化了黑枸杞花色苷的提取工艺。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黑枸杞干果产自青海省德令哈地区,鸿草生物科技(苏州)有限公司惠赠;甲醇、乙醇、丙酮和甲酸南京化学试剂有限公司,分析纯;KCl和无水NaAc上海Aladdin公司,分析纯;DPPH标准品美国SIGMA-ALDRICH公司;磷酸天津科密欧化学试剂有限公司,色谱纯;乙腈美国TEDIA公司,色谱纯。

MDF-U5386S超低温冰箱日本SANYO公司;LGJ-10真空冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司;DZF-6050真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司;AB204-S分析天平瑞士Mettler Toledo公司;PB-10 pH计德国Sartorius公司;Reference超纯水仪美国Millipore公司;KQ-600DE超声波清洗器昆山超声仪器有限公司;THZ-C-1恒温振荡器太仓强乐实验设备有限公司;HH-2恒温水浴锅金坛荣华仪器制造有限公司;5810R高速冷冻离心机、ThermoMixer C恒温混匀仪德国Eppendorf公司;UV2401PC紫外可见分光光度计日本SHIMADZU公司;1260 Infinity高效液相色谱仪美国Agilent公司。

1.2实验方法

1.2.1样品预处理挑选优质黑枸杞干果,去除茎叶;真空冷冻干燥12 h;粉碎机研成粉末;过筛(150 μm);-20 ℃密封避光保藏;使用前真空干燥1 h,得黑枸杞干果粉末。

1.2.2提取工艺称取1 g黑枸杞干果粉末,置于100 mL具塞锥形瓶内;加入15 mL 1%甲酸甲醇(即体积比1∶99),40 ℃避光超声提取30 min;4000 r/min,离心15 min,收集上清液;取沉淀物,按上法再提取1次,合并上清液;40 ℃水浴避光蒸发浓缩;1%甲酸甲醇定容至25 mL,得提取产物。

1.2.3总花色苷含量测定方法参考文献[12],采用pH示差法测定,即取0.2 mL的提取产物,分别加入到3.8 mL、pH1.0、0.025 mol/L氯化钾溶液与3.8 mL、pH4.5、0.4 mol/L醋酸钠缓冲溶液中,室温避光静置适当时间,得pH1.0和pH4.5供试品溶液;分别于最大吸收波长处和700 nm处测定吸光值;按如下经验公式计算总花色苷含量。

总花色苷含量(Total anthocyanins content,TAC,mg/100 g DW)=(A×Mw×DF×103/ε×l)×V×100/m

式中:A(吸光值计算结果)=(Aλmax-A700nm)pH1.0-(Aλmax-A700nm)pH4.5;Mw(分子量)=449.2 g/mol,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计;DF(稀释因子)=4.0 mL/0.2 mL=20;ε(摩尔消光系数)=6,900 L/mol·cm,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计;l(比色皿光径长度)=1 cm;V:提取产物体积;m:提取样品质量。

1.2.4总花色苷含量测定方法的考察采用1.2.3所述方法制备两种供试品溶液,分别考察测定方法的检测波长和静置时间。分别取0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL提取产物,加入到pH1.0和pH4.5缓冲液中至4.0 mL,室温避光静置60 min,制备得不同浓度的两种供试品溶液;于530 nm处测定吸光值,从而考察测定方法的线性范围。

1.2.5DPPH·清除率测定方法参考文献[13]略作改进,取30 μL提取产物或纯水(空白对照),与2 mL、0.4 mmol/L DPPH·甲醇溶液充分混合,40 ℃避光静置40 min,得供试品溶液;使用紫外可见分光光度计于512 nm波长处测定吸光值;采用下式计算其DPPH·清除率。

DPPH·清除率(%)=[Ac-(Ai-Aj)]/Ac×100

1.2.6组成分析方法参考文献[14],建立提取产物组成分析的HPLC法。

1.2.6.1供试品溶液的制备取1 mL提取产物,0.45 μm滤膜过滤,取续滤液注入进样瓶,得提取产物供试品溶液。

1.2.6.2色谱条件色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,400 Bar,pH1.0～8.0);柱温:25 ℃;流动相A:0.5%磷酸,流动相B:乙腈;流速:1 mL/min;梯度洗脱条件:0～10 min:5%～12% B,10～30 min:12%～20% B,30～40 min:20%～50% B,40～42 min:50%～5% B,后运行8 min;二极管阵列检测器(DAD),检测波长:520 nm,光谱扫描:190～640 nm;进样量:10 μL。

1.2.7单因素实验

1.2.7.1提取方式超声、振荡和静置法是花色苷最常见的提取方式,故在1.2.2基础工艺下,采用这3种方式分别提取黑枸杞花色苷,超声功率和振荡转速分别选择300 W和150 r/min。

1.2.7.2提取溶剂苷类成分在甲醇、乙醇、丙酮等极性大的溶剂中溶解度高,且花色苷含有多个酚羟基,呈弱酸性。故采用静置法,分别以1%甲酸甲醇、1%甲酸乙醇、1%甲酸丙酮与1%甲酸作为溶剂提取黑枸杞花色苷,提取温度40 ℃,提取料液比1∶15 g/mL,每次提取30 min,提取2次。同时,考虑到文献常用酸性甲醇作为提取溶剂[2-3],与酸水提取产物的组成可能存在差异,故采用HPLC法对1%甲酸、1%甲酸甲醇和1%甲酸50%甲醇的提取产物进行了分析。其中,为使1%甲酸甲醇提取产物能充分离子化,故将其用纯水稀释1倍。

1.2.7.3提取温度采用静置法,以1%甲酸作为溶剂,分别在不同温度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)的水浴中提取黑枸杞花色苷,提取料液比1∶15 g/mL,每次提取30 min,提取2次。

1.2.7.4提取料液比采用静置法,以1%甲酸作为溶剂,提取温度70 ℃,设置不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)提取黑枸杞花色苷,每次提取30 min,提取2次。

1.2.7.5提取时间采用静置法,以1%甲酸作为溶剂,提取温度70 ℃,提取料液比1∶30 g/mL,设定不同的每次提取时间(10、30 min、1、2、3、4 h)提取黑枸杞花色苷,提取2次。

1.2.7.6提取次数采用静置法,以1%甲酸作为溶剂,提取温度70 ℃,提取料液比1∶30 g/mL,每次提取时间1 h,分别提取不同次数(1、2、3、4、5次)。

1.2.8正交实验优化根据单因素优化结果,选择连续变量中影响最显著的3个因素,即料液比、温度和次数,并在最优水平附近各取三个水平(如表1所示),做L9(34)正交实验优化。

表1　实验因素与水平表

同时,为综合考察各实验的TAC与DPPH·清除率,并考虑到表征抗氧化活性的DPPH·清除率更重要,故将两个指标的权重分别设定为0.45和0.55。为使两个指标的单位统一,故将TAC和DPPH·清除率的最优实验结果分别定为45分和55分,而TAC的其他实验结果得分=TAC其他实验结果×45分/TAC最优实验结果,DPPH·清除率的其他实验结果得分=DPPH·清除率其他实验结果×55分/DPPH·清除率最优实验结果。

1.2.9数据处理与分析方法实验重复3次,结果用Mean±SD表示,统计分析使用SPSS 16.0完成。

2　结果与分析

2.1TAC测定方法的考察

2.1.1检测波长的确定由图1全波长扫描结果可知,pH1.0供试品溶液在可见光区的最大吸收波长为530 nm,吸光值为0.80,而pH4.5供试品溶液在可见光区无明显特征吸收,故选择检测波长为530 nm。

图1　TAC测定的检测波长考察Fig.1　Determination of the wavelength of TAC detection

2.1.2静置时间的确定由图2可知,从10 min开始,随静置时间增加,pH1.0供试品溶液的吸光值逐渐增大,至60 min趋于平稳;而pH4.5供试品溶液至40 min已达到稳定。综合考虑,选择60 min作为TAC测定的静置时间。

图2　TAC测定的静置时间考察Fig.2　Determination of the equilibrium time of TAC detection

2.1.3线性范围的确定建立吸光值计算结果(A)与TAC(X)的回归方程为A=0.001243X+0.02279,相关系数(R2)为0.9958。由此可见,在(46.34～1482.86) mg/100 g DW范围内,吸光值计算结果与TAC间呈现良好的线性关系。

2.2单因素实验

2.2.1提取方式的确定由图3可见,3种提取方式的TAC较为接近(p>0.05);同时,静置提取的DPPH·清除率显著(p<0.05)高于超声提取和振荡提取。由此,选择静置法作为本工艺的提取方式。

图3　提取方式的考察Fig.3　Investigstion of the method of anthocyanins extraction from LRMF

图4　提取溶剂的考察Fig.4　Investigstion of the solvent of anthocyanins extraction from LRMF

2.2.2提取溶剂的确定由图4可知,不同提取溶剂差异很大,1%甲酸甲醇和1%甲酸提取产物的两个指标均极显著优于1%甲酸乙醇和1%甲酸丙酮(p<0.001)。同时,1%甲酸甲醇提取产物的TAC仅略高于1%甲酸(p>0.05),而1%甲酸提取产物的DPPH·清除率却极显著优于1%甲酸甲醇(p<0.001)。

由图5可见,1%甲酸和1%甲酸50%甲醇提取产物均在检测时间内出现7个色谱峰,且保留时间和峰形相近,提示其提取产物一致;而1%甲酸甲醇提取产物仅出现5个色谱峰,但均能与另两种溶剂相对应,其3号和7号峰的缺失可能与提取产物被稀释1倍有关。上述结果表明酸性甲醇和酸水提取产物的组成不存在显著差异,故选择1%甲酸作为提取溶剂。

图5　3种溶剂提取产物的HPLC谱图Fig.5　HPLC spectrum of the extraction products from 3 solvent

2.2.3提取温度的确定如图6所示,不同提取温度的结果差异不大,两个指标随着提取温度升高均略有增加。其次,虽然70 ℃的两个指标均略小于80 ℃和90 ℃,但都未见显著性差异(p>0.05)。同时,已有文献报道花色苷在90 ℃下的降解半衰期为14.5 h[14],可见提取温度过高对花色苷的稳定性不利,故选择70 ℃作为优化工艺的提取温度。

图6　提取温度的考察Fig.6　Investigstion of the temperature of anthocyanins extraction from LRMF

2.2.4提取料液比的确定由图7可见,随着料液比的提高,提取产物的两个指标均先增加,再趋于平稳。其中,1∶30 g/mL的TAC与1∶5～1∶20 g/mL间存在显著性差异(p<0.05),而与1∶40、1∶50 g/mL间的差异不显著(p>0.05);同时,仅料液比1∶5 g/mL的DPPH·清除率与其他料液比间存在显著性差异(p<0.05),而其他料液比间差异不显著(p>0.05)。综合上述结果,并考虑到节约溶剂,故选择1∶30 g/mL作为优化工艺的料液比。

图7　提取料液比的考察Fig.7　Investigstion of the solid-liquid ratio of anthocyanins extraction from LRMF

2.2.5提取时间的确定如图8所示,提取时间对两个实验指标的影响都不大,差异都不显著(p>0.05)。故选择产物TAC含量最高的1 h作为优化工艺的提取时间。

图8　提取时间的考察Fig.8　Investigstion of the time of anthocyanins extraction from LRMF

2.2.6提取次数的确定由图9可知,提取3次产物的TAC和DPPH·清除率均最高,但除提取1次产物以外(p<0.01),其他次数的两个指标间均不存在显著性差异(p>0.05)。为简化工艺,缩短周期,故选择两次作为优化工艺的提取次数。

表2　实验结果与直观分析表

表3　方差分析

图9　提取次数的考察Fig.9　Investigstion of the frequency of anthocyanins extraction from LRMF

注:R2=0.896,调整的R2=0.586。

2.3正交实验优化

实验结果及其直观分析如下表2所示。由直观分析结果的K平均可知,各因素的最优水平组合为A2B3C3,即1∶30 g/mL,75 ℃和3次。由直观分析结果的极差可见,各因素的影响显著性顺序为C>B>A,即提取次数的影响最显著,提取温度次之,而料液比最弱。由表3多因素方差分析可知,各因素与误差均未见显著性差异(p>0.05)。

经过上述考察,确定优化工艺为静置法,1%甲酸,75 ℃,1∶30 g/mL,1 h和3次。

2.4优化工艺的验证

按照基础(1.2.2)和优化工艺分别进行黑枸杞花色苷的提取,结果如表4所示。优化工艺提取产物的两个指标均优于基础工艺,分别达到(450.55±5.91)mg/100 g DW和72.53%±0.60%,相比前者分别提高了17.22%和21.96%(p<0.001)。

表4　优化提取工艺的验证(n=3)

3　结论与讨论

通过单因素和正交实验优化,获得了黑枸杞花色苷优化的提取工艺,即静置法提取,提取溶剂1%甲酸,提取温度75 ℃,料液比1∶30 g/mL,每次提取时间1 h和提取次数3次。在优化工艺条件下提取3批黑枸杞花色苷,其TAC和DPPH·清除率分别为(450.55±5.91) mg/100 g DW和72.53%±0.60%,相比基础工艺分别提高了17.22%和21.96%。

同时,在提取工艺的考察中也发现了一些与文献报道并不完全一致的现象:文献[9-11]常用超声或振荡提取法作为植物花色苷的提取方式,但本研究表明静置提取的TAC与超声、振荡提取接近,但DPPH·清除率却优于后两者。相比其他因素,提取方式对结果的影响可能并不显著。由此,本研究采用DPPH·清除率最高,对设备要求低,成本低廉的静置法作为提取方式。

文献常用酸性甲醇、酸性乙醇或酸性丙酮作为植物花色苷的提取溶剂,但本研究发现1%甲酸丙酮的提取效率最差,提取液近无色;极性相对较弱的1%甲酸乙醇也极显著低于1%甲酸甲醇和1%甲酸;而1%甲酸提取产物的TAC与1%甲酸甲醇相近,但DPPH·清除率却优于后者;HPLC组成分析也提示甲酸和甲酸甲醇提取产物的组成基本一致。鉴于此,本研究采用DPPH·清除率更高,毒性低且便于后续分离工艺的1%甲酸作为提取溶剂。

此外,HPLC组成分析结果(图5)表明1号和5号峰为3种溶剂提取产物的2个主成分峰,其峰面积百分比分别超过13%和79%,且峰纯度均接近阈值。在后续研究中应通过LC-MS归属这2个主成分,从而以其作为标准品,对提取分离产物进行半定量测定。

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Optimization of the extraction process of anthocyanins inLyciumruthenicumMurr.

PAN Zi-hao1,GU Zi-yang1,ZHOU Shuai1,JIANG Yue1,GENG Si-qi1,DING Fan1,PEI Chang-song2,*,PAN Yang1,*

(1.Pharmacy School,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China;2.Urology Surgery Department,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China)

Taken total anthocyanin content and DPPH radical scavenging ratio as indexes,the extraction process of the anthocyanins inLyciumruthenicumMurr.’s fruit(LRMF)had been optimized. By univariate experiment and L9(34)orthogonal test,the selected condition was determined as follows:static extraction(extraction mode),1% formic acid(extraction solvent),75 ℃(extraction temperature),1∶30 g/mL(solid-liquid ratio),1 h(extraction time)and 3 times(extraction frequency). Verification experiment demonstrated that the total anthocyanins content and DPPH radical scavenging ratio of the optimal process was(450.55±5.91)mg/100 g DW and 72.53%±0.60%,respectively,increased by 17.22% and 21.96% in contrast to basic process.

LyciumruthenicumMurr.;anthocyanin;total anthocyanin content;DPPH radical scavenging ratio

2016-02-17

潘自皓(1981-)，男，博士，助理研究员，主要从事生物制药方面的研究，E-mail：Lance814@163.com。

裴昌松(1968-)，男，博士，主任医师，主要从事中医药抗肿瘤方面的研究，E-mail：changsongpei@qq.com。

潘扬(1964-)，男，博士，教授，主要从事生物制药方面的研究，E-mail：y.pan2006@163.com。

江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)；江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015A070)；南京中医药大学校企合作项目(2015001)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)16-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.051