谷氨酰胺在体内和体外试验中对鲤免疫力影响的研究

雷五长，李锦，孙颖，曲木，李静辉，程镇燕



谷氨酰胺在体内和体外试验中对鲤免疫力影响的研究

雷五长，李锦，孙颖，曲木，李静辉，程镇燕通信作者

（天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384）

以鲤的中肾白细胞作为研究对象，研究了谷氨酰胺对鲤免疫细胞免疫力的影响。在培养基中分别添加浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺，在细胞培养2、6、12、24 h后，分别测定白细胞的呼吸爆发活力。结果发现，添加谷氨酰胺后，鲤肾脏白细胞的呼吸爆发活力得到了明显提高（＜0.05），且随着培养时间的延长，呼吸爆发活力呈现先上升后下降的趋势，最高值出现在培养12 h后的2.0 mmol/L谷氨酰胺组。在鲤肾脏白细胞培养12、24 h后，测定鲤肾脏白细胞的吞噬活力，发现白细胞吞噬活力变化趋势和呼吸爆发活力相似，其最高值出现在1.5 mmol/L谷氨酰胺细胞培养24 h后的添加组，鲤肾脏白细胞对迟钝爱德华氏菌杀菌率变化趋势与吞噬活力相符，添加谷氨酰胺后的各组杀菌率最高值发生在1.5 mmol/L谷氨酰胺组，与1.0、2.0 mmol/L谷氨酰胺组之间差异均不显著（＞0.05），但均显著高于对照组及0.5 mmol/L谷氨酰胺组（＜0.05）。将平均体重37 g的鲤鱼分为5组，每组30条，体内注射0、50、100、150、200 mg/kg鱼体重的谷氨酰胺溶液，商业饲料投喂2周后分离中肾获取鲤肾脏白细胞，发现白细胞的呼吸爆发活力和增殖活力随谷氨酰胺浓度的增加而呈现先显著上升后趋于平稳的趋势（＜0.05），而吞噬活力则一直显著升高（＜0.05），最高值均出现在200 mg/kg谷氨酰胺注射组。综合结果表明，谷氨酰胺是鲤有效的免疫增强剂。

鲤；谷氨酰胺；吞噬；呼吸爆发；增殖

谷氨酰胺是哺乳动物体内含量最丰富的氨基酸，是快速分裂的细胞包括活化淋巴细胞和肠上皮细胞重要的能量供体，可促进淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，增加细胞因子TNF、IL-1等的产生和磷脂的mRNA合成[1]。在病理状态下，补充谷氨酰胺可以促进病变或损伤组织（如肝脏或者肠道）的修复和加速患者的恢复[2]。研究表明，谷氨酰胺能增强水产动物的免疫功能[3-4]和抗病力[5]，当培养基中添加谷氨酰胺时，被激活的斑点叉尾鮰巨噬细胞产生NO量的增加，进一步说明了谷氨酰胺作为鱼类免疫系统的细胞代谢燃料的必要性[6]。此外，有研究表明，饲料中补充谷氨酰胺能提高幼年杂交鲟血浆补体蛋白C3和C4[7]，以及美国红鱼嗜中性粒细胞的氧化自由基（NBT）和巨噬细胞超氧阴离子的产生[8]。

近几年，随着鲤的集约化养殖规模的不断扩大，致使病害频繁发生，给渔业生产带来了巨大的经济损失。而大量使用抗生素、消毒剂等化学药物防治疾病不仅增加了生产成本，破坏了水域环境生态，而且导致水产品中药物残留，危害人类健康，因此，寻求病害防治新方法迫在眉睫。研究谷氨酰胺对鲤体细胞免疫力的影响，探讨谷氨酰胺调节鲤免疫力的机理具有重要的学术意义，同时也为生产上提高鲤的免疫力、抗病力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

体外试验：将平均体重约37 g的鲤放养在水温（23±0.2）℃的水族箱中暂养，投喂商业饲料，暂养2周后取出6尾鲤，小心切除头肾和中肾并放置于经过预先消毒处理过的培养基中，收集切除下来的头肾和中肾，使其形成一个复合样品用于下一步试验中的白细胞分离。向RPMI-1640培养基中分别加入浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺（Amresco公司），得到浓度不同的5种培养基，用于白细胞的培养。用两个独立的复合样品（每个样本3个重复）进行免疫学各项指标的测定。

体内试验：将平均体重约37 g的鲤放养在水族箱中，保持水温（23±0.2）℃，暂养1周后，将鱼随机分成5组，每组3个重复，每个水族箱放10尾鱼，向腹腔中分别注射 0、50、100、150、200 mg/kg鱼体重的谷氨酰胺溶液。之后继续投喂商业饲料，养殖2周后取样，取头肾放于生理盐水中清洗表面血污，然后放在配制好的培养液中，待测。

1.2 样品制备与测定

在尼龙网（100 μm）上，用研磨棒仔细研磨过滤上述用剪刀剪碎处理好的鲤中肾样品，然后不断用新的RPMI-1640培养基冲洗正在研磨的鲤中肾样品（由2%的小牛血清、10 u/mL的肝素和100 u/mL青霉素/链霉素配置成此RPMI-1640培养基）。放在不连续的34%/51%的珀可溶液中，并在4 ℃下400 g离心25 min。收集位于交界处的细胞带，然后将细胞悬浮物重新悬浮于培养基中，调整细胞悬浮液浓度至2×107个细胞/ mL，并用台盼蓝染色测定活力，要求活力均大于95%。

白细胞的呼吸爆发活力、吞噬活力、增殖能力的测定均参考王庆奎[9]的方法进行，将分离的肾白细胞悬液用HBSS调整浓度为 5×106个细胞/ mL，用于测定呼吸爆发活力。呼吸爆发系数（Respiratory Burst Index，）＝刺激孔690-未刺激孔690。将分离的肾白细胞悬液用HBSS调整浓度为 5×107个细胞/mL，用于测定白细胞的吞噬活力，吞噬活力＝试验孔608-对照孔608。将肾白细胞用RPMI-1640增殖液（含5% 胎牛血清、2% 热灭活鲤鱼血清、100 IU/mL 氨苄青霉素和0.1 mg/mL硫酸链霉素）重悬，调整细胞浓度为5×105个细胞/mL，测定白细胞的增殖能力。刺激指数（Stimulation Index，）＝（受刺激细胞的平均550/未受刺激细胞的平均550）-1。

1.3 数据处理

所得数据用平均值表示，使用SPSS 16.0统计软件做单因素方差分析（One-way ANOVA），若差异达到显著（＜0.05），则进行Ducan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 培养基中补充谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞呼吸爆发活力的影响

由图1看出，在培养基中添加谷氨酰胺，且分别培养2、6、12、24 h后，鲤肾脏白细胞的呼吸爆发活力与没有添加谷氨酰胺的对照组相比显著提高。培养2 h后，添加谷氨酰胺组显著高于对照组（＜0.05），其余各组间差异不显著（＞0.05）；培养6 h后，添加谷氨酰胺的各组呼吸爆发活力均高于对照组，但各组间均没有显著差异（＞0.05）；培养12 h后，0.5 mmol/L组与对照组间没有显著差异，均显著低于1.0、1.5、 2.0 mmol/L添加组（＜0.05）；培养24 h后，呼吸爆发活力与12 h相比，有所下降，0.5 mmol/L组与对照组间没有显著差异，添加谷氨酰胺的各组间也没有显著差异。随着培养时间的延长，呼吸爆发活力呈现先上升后下降的趋势，在各个培养时间段，呼吸爆发活力的最高值均出现在 2.0 mmol/L谷氨酰胺添加组。

（注：图中所给数据为平均值，同组不同字母表示差异显著（＜0.05），下同）

2.2 培养基中补充谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞吞噬活力的影响

由图2看出，经过培养12 h和24 h后，鲤肾脏白细胞的吞噬活力与没有添加谷氨酰胺的对照组的吞噬活力相比，其吞噬活力有了一定提高。经过培养12 h后，1.0、1.5、2.0 mmol/L组间无显著差异（＞0.05），0.5 mmol/L与对照组间无显著差异（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L组吞噬活力均显著高于0.5 mmol/L谷氨酰胺组与对照组。随着培养时间的延长，培养24 h后，添加 0.5 mmol/L谷氨酰胺组显著高于对照组（＜0.05），而1.0、1.5、2.0 mmol/L组间差异不显著（＞0.05），但均显著高于对照组和0.5 mmol/L谷氨酰胺组（＜0.05）。

2.3 培养基中补充谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞增殖效果的影响

如图3所示，添加谷氨酰胺培养12 h后， 0.5 mmol/L谷氨酰胺组白细胞的增殖效果与没有添加谷氨酰胺的对照组相比，无显著差异（＞0.05），添加1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺的各组间差异不显著（＞0.05），与对照组间存在显著差异（＜0.05），最高值发生在1.5 mmol/L谷氨酰胺组。培养48 h后，0.5 mmol/L谷氨酰胺组与对照组间没有显著差异（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺组与对照组间均存在显著差异（＜0.05），1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺组间没有显著差异（＞0.05），最高值发生在2.0 mmol/L谷氨酰胺组。

2.4 谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞呼吸爆发、吞噬和增殖活力的影响

从表1可知，注射25、50 mg/kg谷氨酰胺的鲤鱼，其呼吸爆发活力与对照组间没有显著差异（＞0.05），注射100、200 mg/kg 谷氨酰胺的鲤鱼，其呼吸爆发活力显著高于对照组（＜0.05）。

表1 谷氨酰胺对鲤鱼肾脏白细胞呼吸爆发、吞噬和增殖活力的影响

注：表中小写字母表示＝0.05水平上差异显著

在吞噬活力中，各组间均存在显著差异（＜0.05），最高值出现在200 mg/kg组。在增殖活力中，25 mg/kg谷氨酰胺组与对照组没有显著差异（＞0.05），50、100、200 mg/kg谷氨酰胺处理组增殖能力均显著高于对照组（＜0.05），最高值出现在200 mg/kg处理组。由表1可以看出，鲤鱼肾脏白细胞的呼吸爆发活力、吞噬和增殖能力均随注射谷氨酰胺浓度的增高而增高。

3 讨论

3.1 谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞呼吸爆发活力的影响

呼吸爆发是组织在重新获得氧供应的短时间内，激活的中性粒细胞耗氧量显著增加，产生大量氧自由基，是在细胞发挥免疫作用中，病原微生物被吞噬后，免疫细胞的一种氧依赖的杀伤机制。体外试验表明，添加了谷氨酰胺各个组鲤肾脏白细胞的呼吸爆发活力都比未添加谷氨酰胺的对照组有不同程度的提高，体内试验结果也表明，随着谷氨酰胺浓度的增加，白细胞呼吸爆发活力显著提高。因此，无论是在培养基中添加还是体内注射谷氨酰胺都有助于鲤白细胞产生NO，进而刺激超氧阴离子的产生，提高呼吸爆发活力。有研究表明，在饲料中补充适当的谷氨酰胺能提高嗜中性粒细胞的氧化自由基（NBT）和巨噬细胞超氧阴离子的产生[8]，大量自由基能够杀死吞入胞内的病原，细胞的吞噬和杀菌能力也增强，从而提高细胞的免疫力。这一试验结果与本试验结果相符，相似的结果也在斑点叉尾鮰[10]上得到验证。

3.2 谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞吞噬活力的影响

吞噬细胞的吞噬作用是鱼类最重要的非特异性免疫反应，在免疫调节中起着重要作用。白细胞作为重要的免疫细胞起着吞噬细菌、预防疾病的作用。有研究表明，谷氨酰胺为哺乳动物吞噬细胞提供能量ATP，为细胞合成DNA和mRNA提供嘌呤、嘧啶、核苷酸生物合成的前体物质，谷氨酰胺还能合成精氨酸，精氨酸的代谢产物NO在免疫调节方面发挥重要作用[1]。在本研究中，补充谷氨酰胺后，白细胞的吞噬活力显著提高，这一结论和在斑点叉尾鮰[10]和牙鲆[11]上的研究结果相同。体外试验中，随着谷氨酰胺浓度的升高，白细胞的吞噬活力趋于稳定，与在体内的研究结果略有不同，有研究表明，高剂量胞外谷氨酰胺会干扰内皮细胞和吞噬样细胞系NO的产生[12]，所以，随着谷氨酰胺浓度的进一步升高，白细胞的吞噬、呼吸爆发活力和增殖能力可能不会进一步提高，反而得到抑制，但仍需进一步研究来证实。

3.3 谷氨酰胺对鲤肾脏白细胞增殖的影响

研究表明，谷氨酰胺可促使哺乳动物淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖[1]。也有研究表明，谷氨酰胺可作为鱼类免疫系统细胞代谢的燃料[6]。本研究中发现，无论是体外试验还是体内试验，添加谷氨酰胺后，白细胞的增殖效果得到显著提高，这一结果与在斑点叉尾鮰[10]、石斑鱼[13]、鲤鱼[14]上的研究结果相似，但在虹鳟[15]和鲷鱼[16]上的研究中表明，在没有谷氨酰胺的情况下，细胞依然增殖良好。不同的试验结果与试验动物的种类有关，尤其是谷氨酰胺在水产动物上的研究还处于初级阶段，谷氨酰胺作为哺乳动物必需的细胞能量供体，在鱼类上是否有类似效果还需进行深入探讨。

参考文献：

[1] Krebs H A，Baverel G，Lund P. Effect of bicarbonate on glutamine metabolism [J].，1980，12（1/2）：69-73.

[2] Diestel C F，Marques R G，LopesP F，et al. L-glutamine supplementation optimizes the repair of the colonic mucosa in rats subjected to abdominal irradiation [J].，2007，27（10）：647-652.

[3] 朱青，许红，徐奇友，等. 谷氨酰胺对幼鲟鱼血清、肝胰脏生化指标及体成分的影响[J]. 水产学杂志，2010，23（2）：16-20.

[4] 林燕. 谷氨酰胺对幼建鲤肠道功能和免疫力的影响[D]. 雅安：四川农业大学，2005.

[5] 杨奇慧，周歧存，谭北平，等. 谷氨酰胺对杂交罗非鱼生长、饲料利用及抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2008，15（6）：1016-1023.

[6] Buentello J A，Gatlin III D M. Nitric oxide production in activated macrophages from channel catfish（）：influence of dietary arginine and culture media [J].，1999，179（1）：513-521.

[7] Zhu Q，Xu Q Y，Xu H，et al. Dietary glutamine supplementation improves tissue antioxidant status and serum non-specific immunity of juvenile hybrid sturgeon（）[J].，2011，27（2）：715-720.

[8] Cheng Z Y，Buentello J A，Gatlin III D M. Effects of dietary arginine and glutamine on growth performance，immune responses and intestinal structure of red drum，[J].，2011，319（1）：247-252.

[9] 王庆奎. 当归多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响[D]. 青岛：中国海洋大学，2012.

[10] Pohlenz C，Buentello J A，Mwangic W，et al. Arginine and glutamine supplementation to culture media improves the performance of various channel catfish immune cells [J].，2012，32（5）：762-768.

[11] Galindo-Villegas J，Fukada H，Masumoto T，et al. Effect of dietary immunostimulants on some innate immune responses and disease resistance againstinfection in Japanese flounder（）[J].，2006，54（54）：153-162.

[12] Bryk J，Ochoa J B，Correia M I，et al. Effect of citrulline and glutamine on nitric oxide production in RAW 264.7 cells in an arginine-depleted environment [J].，2008，32（4）：377-383.

[13] 程镇燕，李健，雷五长，等. 谷氨酰胺对点带石斑鱼免疫细胞免疫力的影响[J].水产科学，2014，33（10）：606-610.

[14] Rosenberg-Wiser S，Avtalion R R. The cells involved in the immune response of fish. III. Culture requirements of PHA-stimulated carp（）lymphocytes [J].，1982，6（4）：693-702.

[15] Ganassin R C，Barlow J，Bols N C. Influence of glutamine on phytohemagglutinin stimulated mitogenesis of leucocytes from the rainbow trout head kidney [J].，1998，8（7）：561-564.

[16] McBride S，Keast D. Mitogenesis of snapper lymphocytes and their requirement for glutamine [J].，1997，21（2）：91.

Effects of Glutamine on Immunity of CarpandExperiments

LEI Wu-chang，LI Jin，SUN Ying，QU Mu，LI Jing-hui，CHENG Zhen-yanCorresponding Author

（Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture，College of Fishery Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

This experiments were conducted to evaluate the effects of glutamine on the immune responses of kidney leukocytes in common carp. Five different groups were formulated by supplementing 0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L glutamine into the basal culture medium. After the leukocytes were cultured 2，6，12，24 h，the respiratory burst activity of leukocytes were determined，respectively. The results showed that with glutamine supplemented into the culture medium，respiratory burst activity of leukocytes significantly improved and with prolongation of culture time and respiratory burst activity increased firstly（＜0.05），and then decreased. The peak occurred in 2.0 mmol/L glutamine group at 12 h. And then，leukocyte phagocytic activity was determined after cultured for 12 h and 24 h. The phagocytic activity change trend was similar with respiratory burst activity，the highest value occurred in 1.5 mmol/L glutamine group at 24 h. And no significant differences were found in 1.0，1.5， 2.0 mmol/L glutamine group，but the killing ability of leukocytesin these three groups were significantly higher than that in basal group and 0.5 mmol/L glutamine group（＜0.05）.experiment，the average weight 37 g carp were divided into 5 groups. 0，50，100，150，200 mg/kg glutamine were injected to five different group. Then，fish was fed commercial diet for 2 weeks. Results demonstrated that with the increasing concentration of glutamine the kidney leukocyte respiratory burst and phagocytosis activity significantly increased firstly（＜0.05），and then leveled off，while the proliferation activity kept increased significantly（＜0.05）. The results of this experiment indicate that glutamine is the effective immunomodulatory in carp leukocytes.

; glutamine; phagocytosis; respiratory burst; proliferation

S963.71

A

1008-5394（2016）03-0035-04

2015-12-14

天津农学院大学生创新计划项目“研究离体条件下谷氨酰胺对石斑鱼体细胞免疫力的影响”（11-D-3）

雷五长（1988-），男，福建三明人，学士，主要从事水产动物营养与饲料研究。E-mail：leiwuchangnumber@163.com。

程镇燕（1981-），女，山东泰安人，副教授，博士，研究方向为鱼类营养生理与免疫。E-mail：chengzhenyan2005@126.com。