DEAE琼脂糖凝胶纯化龙胆多糖及其分子特性

肖 健，曹荣安*，贾 建，梁茜茜，李泽伟，魏恭禄，王 巍

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

DEAE琼脂糖凝胶纯化龙胆多糖及其分子特性

肖 健，曹荣安*，贾 建，梁茜茜，李泽伟，魏恭禄，王 巍

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

以龙胆为原料提取龙胆多糖，纯化后对其分子特性进行研究。通过正交试验确定了龙胆多糖的最佳提取参数：浸提时间2.5 h、浸提温度90 ℃、液料比20∶1（V/m），得率为12.80%。利用DEAE琼脂糖凝胶柱对龙胆多糖粗品进行纯化，得到F1和F2两个分离组分，得率分别为14.1%和63.4%。化学组成分析表明龙胆多糖粗品、F1和F2是由不同含量的总糖、蛋白质、硫酸根和糖醛酸组成的，单糖组成主要包括阿拉伯糖和半乳糖，同时含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。采用高效尺寸排阻色谱-紫外检测器-多角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统对多糖的分子质量及分布进行分析，结果表明龙胆粗品、F1和F2分子质量（Mw）为67.2×103～788.4×103u，回转半径（Rg）为90.2～321.1 nm。研究确定了龙胆多糖的提取参数，并通过离子交换柱进行纯化，分析了龙胆多糖的分子特性，为下一步的生物活性研究奠定了基础。

龙胆；多糖；分离纯化；分子特性

肖健， 曹荣安， 贾建， 等. DEAE琼脂糖凝胶纯化龙胆多糖及其分子特性［J］. 食品科学， 2016， 37（15）: 130-135.

XIAO Jian， CAO Rongan， JIA Jian， et al. Purification and molecular characterization of polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE sepharose fast flow chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 130-135. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

龙胆（Gentianae Radix et Rhizoma）为龙胆科植物龙胆的根和根茎［1］，临床上用于治疗肝胆疾病、高血压病、急性肾盂肾炎、病毒性角膜炎、皮肤病、急性咽炎、慢性支气管炎、上呼吸道感染、结膜炎等疾病［2］。龙胆在国际上亦为天然药物，被收载为苦味健胃剂［3］。龙胆多糖为龙胆的有效成分之一，而多糖作为一类天然高分子化合物受到研究者的日益重视。多糖是由醛糖或酮糖组成的，由10 个以上单糖通过糖苷键连接而成的多聚物，是构成生命的四大基本物质之一，在生命活动中扮演重要角色［4-5］。人们对于糖类的早期研究只注意到它作为细胞的组成成分和能源物质的重要性，后来发现有些多糖可以作为细胞表面专一的识别信号，起传递信息的作用，参与生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，例如多糖具有抗病毒［6］、抗衰老［7］、抗炎［8］、抗癌［9］、抗凝［10］、抗血栓［11］、降血糖和治疗糖尿病［12-13］等作用，还有免疫调节与抗肿瘤的生物学功效，它能激活免疫受体，提高机体的免疫功能［6，8］。而且多种植物和真菌多糖例如人参、黄芪、灵芝、茯苓和香菇多糖可以增强癌症患者免疫力、改善临床症状、提高生活质量、延长生存时间等，已被广泛用于各种肿瘤的治疗［14］。本实验以龙胆为原料提取龙胆多糖，进行提取参数的研究，并对其进行分离纯化， 进而分析其化学成分、单糖组成、分子质量及分布。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

龙胆购自安徽亳州兹元堂。

DEAE琼脂糖凝胶 美国GE Healthcare公司；蛋白质定量试剂盒 美国Bio-Rad公司；单糖标准品、牛血清白蛋白、明胶、葡萄糖醛酸 美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

3802 UV/VZS分光光度计 美国Unico公司；TSK Gel色谱柱 日本Tosoh公司；2487紫外检测器、2414示差折光检测器 美国Waters公司；DAWN HELEOS多角度激光光散射检测器 美国Wyatt公司；6890N/ MSD5973气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司。

1.3方法

1.3.1龙胆多糖提取参数研究

1.3.1.1提取工艺

采用水提醇沉法提取龙胆多糖，工艺如下：挑选龙胆原料除杂后60 ℃烘干，研磨过40 目筛，加入85%乙醇，70 ℃加热回流搅拌2 h，冷却后室温搅拌12 h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥。按照一定的液料比加入蒸馏水进行浸提，浸提两次，合并两次的提取液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇的体积分数为80%，搅拌10 min后放入4 ℃冰箱中静置12 h，离心后弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，称质量后按照下式计算多糖得率。

1.3.1.2单因素试验

液料比对多糖得率的影响：选取液料比（V/m）分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，浸提温度80 ℃，浸提时间2 h，进行多糖的提取，研究液料比对多糖得率的影响。

浸提温度对多糖得率的影响：液料比（V/m）10∶1，选取浸提温度分别为75、80、85、90、95 ℃，浸提时间为2 h，进行多糖的提取，研究浸提温度对多糖得率的影响。

浸提时间对糖得率的影响：液料比（V/m）10∶1，浸提温度80 ℃，选取浸提时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，进行多糖的提取，研究浸提时间对多糖得率的影响。

1.3.1.3正交试验

根据单因素试验结果，3 个因素各选取3 个水平进行正交试验，从而最终确定提取龙胆多糖的最佳参数，并利用最佳参数进行提取，测定龙胆多糖得率。

1.3.2龙胆多糖的纯化

250 mg龙胆多糖溶于10 mL蒸馏水中，60 ℃溶解，3 ☒m膜过滤后注入DEAE琼脂糖凝胶柱进行纯化，洗脱液分别为蒸馏水，0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl溶液，分别洗脱5 h，洗脱速率为1.5 mL/min。蒸馏水洗脱2 h后开始收集解析液，10 min/管。按照苯酚-硫酸法［15］测定解析液的总糖含量，合并相应的溶液，浓缩、透析后冻干得到多糖分离组分。

1.3.3总糖含量测定

总糖含量测定参照Dubois等［15］的苯酚-硫 酸法：多糖配制成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。溶液中加入5%苯酚溶液后旋涡振荡，加入浓硫酸溶液，充分旋涡振荡，室温反应20 min后在490 nm波长处测定吸光度。选择葡萄糖为标准品，将样品吸光度带入标准曲线计算出样品中总糖含量。

1.3.4蛋白质含量测定

蛋白质含量测定采用Lowry法（福林-酚法）［16］，使用蛋白质定量试剂盒：多糖配制成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。溶液加入试剂 A，充分旋涡振荡，室温反应10 min。加入试剂B，充分旋涡振荡，室温反应15 min后在750 nm波长处测定吸光度。选择牛血清白蛋白为标准品，将样品吸光度带入标准曲线计算出样品中蛋白质含量。

1.3.5硫酸根含量测定

硫酸根含量测定采用Dodgson等［17］的氯化钡-明胶浊度法：多糖用0.5 mol/L HCl溶液在110 ℃烘箱中水解5 h。水解液加入质量浓度为3 g/100 mL三氯乙酸溶液，旋涡振荡后再加入氯化钡-明胶溶液，室温反应20 min后在360 nm波长处测定吸光度。选择硫酸钾为标准品，将样品吸光度带入标准曲线计算出样品中硫酸根含量。

1.3.6糖醛酸含量测定

糖醛酸含量测定采用Filiset ti-Cozzi等［18］的间羟基联苯法：多糖配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。样品溶液加入磺酰胺钾溶液（pH 1.6），旋涡振荡后加入四硼酸钠-硫酸溶液，充分旋涡振荡，100 ℃沸水中反应20 min，冰浴中迅速冷却，加入质量浓度为0.15 g/100 mL间羟基联苯溶液（溶解在质量浓度为0.5 g/100 mL氢氧化钠溶液中），对照组仅加入质量浓度为0.5 g/100 mL氢氧化钠溶液。充分旋涡振荡后室温反应10 min，在535 nm波长处测定吸光度，采用葡萄糖醛酸为标准品，将样品吸光度减去对照组吸光度的结果带入标准曲线，从而计算出样品中糖醛酸含量。

1.3.7单糖组成分析

参考Ciucanu等［19］的方法并稍作改动（样品处理全过程需要氮气保护）：样品和7 种单糖标准品（鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）分别加入三氟乙酸，100 ℃水解6 h，之后分别加入硼氘化钠（NaBD4）和无水醋酸进行还原和乙酰化，制得相应的糖醇乙酸酯衍生物。注入1 μL到GC-MS仪中进行分析，采用的是HP-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气作为氦气，流速为1.2 mL/min。升温程序为160～210 ℃（10 min之内），之后10 min内以5 ℃/min升温到240 ℃，保持在250 ℃，进样口温度也保持在250 ℃。用电子轰击源（electron impaction，EI）分析，电子能量为70 eV，质量扫描范围为35～450 m/z。根据气相色谱出峰时间和质谱的离子峰与单糖标准品进行对比从而确定单糖组成。

1.3.8分子质量及分布测定

多糖配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液，60 ℃加热溶解，3 ☒m膜过滤后注入排阻色谱-紫外检测器-多角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统中测定分子质量及分布情况。采用牛血清白蛋白对仪器进行校正，流动相是0.15 mol/L NaNO3和0.02% NaN3，流速为0.4 mL/min，结果分析采用ASTRA 6.1软件。

1.4数据统计分析

2　结果与分析

2.1龙胆多糖的提取条件

2.1.1单因素试验结果

对于龙胆多糖提取参数的研究，首先进行了单因素试验，选取的因素包括液料比、浸提温度和浸提时间。液料比对多糖得率的影响见图1，在液料比（V/m）10∶1～20∶1范围内，随着液料比的增大，多糖得率呈明显上升趋势，当液料比（V/m）为20∶1时，多糖得率最高，为11.50%，之后随着液料比的继续升高，多糖得率呈现下降趋势，所以选取15∶1、20∶1、25∶1为进行龙胆多糖提取正交试验的液料比（V/m）。

图1　液料比对多糖得率的影响Fig. 1 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides

浸提温度对多糖得率的影响见图2，可知在75～90 ℃范围内，随着温度的升高，多糖得率呈明显上升趋势，当浸提温度为90 ℃时多糖得率最高，为11.60%，之后随着温度的继续升高，多糖得率呈现下降趋势，所以选取85、90、95 ℃为进行龙胆多糖提取正交试验的温度。

图2 浸提温度对多糖得率的影响Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

图3为浸提时间对多糖得率的影响，可知在1.0～2.0 h内，随着浸提时间的延长，多糖得率呈明显上升趋势，当浸提时间为2.0 h时多糖得率最高，为11.47%，之后随着浸提时间的继续延长，多糖得率呈现下降趋势，所以选取1.5、2.0、2.5 h为进行龙胆多糖提取正交试验的时间。

图3　浸提时间对多糖得率的影响Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

2.1.2正交试验结果

根据单因素试验结果，选取液料比（V/m）15∶1、20∶1、25∶1，浸提温度85、90、95 ℃，浸提时间1.5、2.0、2.5 h进行正交试验，试验设计和结果见表1。

表1　正交试验设计和结果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

通过比较R值可知影响龙胆多糖得率因素的主次顺序为C浸提时间＞B浸提温度＞A液料比。通过k值的比较确定提取龙胆多糖的最佳组合为A2B2C3，即液料比20∶1、浸提温度90 ℃、浸提时间2.5 h，龙胆多糖得率为12.80%。同时也有其他研究者对龙胆多糖的提取参数进行了研究，王晨瑜等［20］确定水溶性龙胆多糖的最佳提取工艺条件为：提取温度100 ℃、料液比1∶25、提取时间3.0 h、提取次数2 次，而Wang Chenyu等［21］从龙胆中提取水溶性多糖最佳参数为：提取温度100 ℃、料液比1∶26.56、提取时间3 h、提取2 次，通过本实验确定的提取参数与以上两篇文献的参数相近。同时本实验中龙胆多糖的得率为12.80%，这也与史伟国［22］、王晨瑜［20］和Wang Chenyu［21］等所报道的龙胆多糖的提取率分别为12.59%、14.0%和13.0%的结果相近，提取参数和提取率上的一些差别可能是由于龙胆原料产地、提取实验条件和设备差异造成的。

2.2龙胆多糖纯化结果

利用DEAE琼脂糖凝胶柱对提取得到的龙胆多糖粗品进行纯化，之后按照苯酚-硫酸法测定收集液的吸光度，以洗脱体积为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出洗脱图。由图4可知，经过洗脱后得到两个洗脱峰，分别命名为分离组分F1和F2，可知F1主要是由蒸馏水洗脱出来的中性多糖，而F2主要是由0.5 mol/L NaCl洗脱出来的酸性多糖。将F1和F2溶液浓缩、透析后冻干，称质量后计算得率，F1的得率为14.1%，F2的得率为63.4%。

图4　龙胆多糖的DEAE琼脂糖凝胶柱洗脱曲线Fig. 4 Elution profile of the crude polysaccharide from Gentianae Radix et Rhizoma on DEAE Sepharose fast flow

2.3龙胆多糖的化学组成

对龙胆多糖粗品和分离组分F1、F2的化学成分和单糖组成进行了测定，结果见表2。龙胆多糖粗品主要由59.0%总糖、12.8%蛋白质、6.8%硫酸根和26.7%糖醛酸组成，而F1和F2的化学成分别为总糖91.2%和58.9%、蛋白质4.1%和12.2%、硫酸根6.4%和9.2%、糖醛酸0.7%和28.8%。图5是单糖标准品和龙胆多糖衍生物的总离子流色谱图和质谱图，图5A是7 种单糖标准品的总离子流色谱图和质谱图，按照出峰时间先后顺序对应的单糖分别为鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中鼠李糖和岩藻糖衍生物的质谱图是一致的，阿拉伯糖和木糖衍生物的质谱图是一致的，甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的质谱图是一致的。图5B、C、D分别为龙胆多糖粗品、F1和F2衍生物的总离子流色谱图，根据出峰时间和质谱图对比确定对应单糖的种类，同时根据峰面积计算单糖组成和比例。由表2可知，龙胆多糖粗品主要由阿拉伯糖（42.6%）和半乳糖（43.8%）组成，同时含有少量的葡萄糖（5.3%）、鼠李糖（4.8%）、甘露糖（2.7%）和木糖（0.8%）。F1和F2的单糖组成同粗品也非常相近，也是主要由阿拉伯糖（分别为53.3%和40.1%）和半乳糖（分别36.6%和47.7%）组成，同时分别含有5.3%和2.8%的葡萄糖、0.3%和7.5%的鼠李糖、3.8%和1.3%的甘露糖、0.7%和0.6%的木糖。王赫［23］从龙胆水溶性多糖中分离纯化得到2 种不同的均一多糖组分TP-1、TP-2，经气相色谱法检测，二者主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成，同时含有少量的岩藻糖、木糖和甘露糖。而本实验分析确定的龙胆多糖的单糖组成主要为阿拉伯糖和半乳糖，葡萄糖的含量非常少，造成这种差别的原因可能是采用的龙胆原料和纯化方法的不同，王赫采用的是Sephadex G100型凝胶柱纯化龙胆多糖，而本研究采用的是DEAE琼脂糖凝胶柱。

表2　龙胆多糖粗品和分离组分的化学成分和单糖组成及含量Table 2 Chemical and monosaccharide compositions and content of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

图5　单糖标准品和龙胆多糖糖醇乙酸酯衍生物的总离子流色谱图和质谱图Fig. 5 Total ion current chromatogram and mass spectra for alditol acetates derivatives of monosaccharides and polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma

2.4龙胆多糖的分子质量及分布

采用高效尺寸排阻色谱-紫外检测器-多角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统对龙胆多糖的分子质量及分布情况进行了研究，示差折光检测曲线和紫外色谱见图6。龙胆多糖粗品示差折光检测曲线（图6A）上有峰形不对称的两个峰，分别为洗脱时间30～42 min的峰Ⅰ和42～51 min的峰Ⅱ。F2也存在两个峰（图6C），分别为洗脱时间32～45 min的峰Ⅰ和45～51 min的峰Ⅱ，可知粗品和F2不是均一多糖。而F1在洗脱时间为40～51 min内只存在一个峰形对称的峰（图6B），说明其是均一多糖。同时粗品和F2也存在明显的紫外检测峰，而F1的紫外检测峰非常小，说明粗品和F2含有一定的蛋白质，而F1的蛋白质含量很低，这与2.3节化学组成检测中F1蛋白质含量较低的结果是相互吻合的。

同时利用ASTRA 6.1软件进行分析，得到分子质量（Mw）和回转半径（Rg）的数值见表3。可知粗品峰Ⅰ和峰Ⅱ的Mw分别为616.5×103、246.9×103u，Rg分别为90.2、270.2 nm。F1的Mw为67.2×103u，Rg为178.6 nm。F2的峰Ⅰ和峰Ⅱ的Mw分别为788.4×103、185.1×103u，Rg分别为90.3、321.1 nm。

图6　龙胆多糖粗品和分离组分的示差折光检测曲线和紫外色谱图Fig. 6 RI and UV chromatograms of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

表3　龙胆多糖粗品和分离组分的分子质量和回转半径Table 3 Molecular weights and radii of gyration of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

3　结 论

本研究确定了提取龙胆多糖的最佳参数为浸提时间2.5 h、浸提温度90℃、液料比20∶1（V/m），此条件下龙胆多糖得率为12.80%。利用DEAE琼脂糖凝胶柱进行纯化，得到了极性不同的龙胆多糖组分F1和F2。化学组成分析表明龙胆多糖是由总糖、蛋白质、硫酸根和糖醛酸组成的，单糖组成主要包括阿拉伯糖和半乳糖，同时含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。粗品、F1和F2的Mw为67.2×103～788.4×103u，Rg为90.2～321.1 nm，同时分子质量分布表明粗品和F2不是均一多糖，而F1是均一多糖。通过本研究明确了龙胆多糖的提取参数、 纯化方法和分子特 性，为下一步对其生物活性和构效关系的分析奠定了基础。

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Purification and Molecular Characterization of Polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE Sepharose Fast Flow Chromatography

XIAO Jian， CAO Rongan*， JIA Jian， LIANG Xixi， LI Zewei， WEI Gonglu， WANG Wei
（College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

The molecular characterization of the polysaccharides purified from Gentianae Radix et Rhizoma was investigated in this study. By using orthogonal array design， the optimal extraction parameters that provided the maximum yield of polysaccharides of 12.80% were determined as follows: extraction time 2.5 h， temperature 90 ℃， and ratio of liquid to solid 20:1 （V/m）. The crude polysaccharide was purified by DEAE sepharose fast flow chromatography to obtain two fractions，F1and F2， with a yield of 14.1% and 63.4%， respectively. All the crude polysaccharide and purified fractions were composed of neutral sugar， protein， sulfate and uronic acid with various ratios. Arabinose and galactose were the major monosaccharide units along with a small portion of glucose， rhamnose， mannose and xylose. The molecular weights （Mw） and radii of gyration（Rg） of all three samples ranged from 67.2 × 103to 788.4 × 103u and from 90.2 to 321.1 nm， respectively， as determined by HPSEC-UV-MALLS-RI system. The results obtained in this study can provide the basis for further bioactivity studies.

Gentianae Radix et Rhizoma； polysaccharides； separation and purification； molecular characterization

10.7506/spkx1002-6630-201615022

TS201.1

A

1002-6630（2016）15-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

2015-11-05

2015年黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（201510223010）；黑龙江八一农垦大学2014年度校内培育课题（XZR2014-08）；黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动计划项目（XDB2015-30）

肖健（1994—），男，本科生，研究方向为食品科学。E-mail：1501800314@qq.com

曹荣安（1980—），男，讲师，博士，研究方向为天然生物活性产物。E-mail：racao@163.com

引文格式：