穿入现象在自身免疫性肝炎中的临床意义

卞兆连　秦刚　陈琳　邵建国　苗琪　马雄



·论著·

穿入现象在自身免疫性肝炎中的临床意义

卞兆连秦刚陈琳邵建国苗琪马雄

目的研究自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)中发生穿入现象的概况以及其临床意义。方法H&E染色后在显微镜下观察，AIH患者肝组织是否存在细胞穿入现象；通过Ishak评分系统对每一例AIH患者肝内炎症及纤维化评分，并对每例患者行界面性肝炎、浆细胞浸润以及玫瑰花结等情况的评估；随后，通过统计学分析AIH患者肝组织中发生穿入现象的比例，并分析穿入现象与肝内炎症及纤维化的关系以及与AIH特征性病理表现之间的关系。结果57.3% AIH患者肝组织中发现穿入现象，穿入现象发生后宿主肝细胞嗜伊红染色；随着AIH患者肝内炎症及纤维化的加重，穿入现象的发生比例逐渐增高，差异有统计学意义；发生穿入现象的AIH患者肝内界面性肝炎较无穿入组明显加重，同样在发生穿入组患者肝内玫瑰花结的发生率增加，而与浆细胞浸润无明显相关性。结论穿入现象可能是诊断AIH的重要病理学特征，并可能是AIH患者肝细胞损伤的机制。

穿入现象；自身免疫性肝炎；界面性肝炎；玫瑰花结

自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)临床表现为不同程度的肝功能损伤，主要以丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高为主，血清自身抗体阳性，高免疫球蛋白G和(或)γ-球蛋白血症，随着疾病不断发展，可进展为肝硬化、肝功能衰竭等终末期肝病，严重影响患者预后及生活质量。AIH的临床表现多种多样，一般表现为慢性、隐匿性起病，但也可表现为急性发作，甚至表现为急性肝功能衰竭。AIH的病理学特征表现主要包括中-重度界面性肝炎、玫瑰花结以及淋巴-浆细胞浸润。2015年我国《自身免疫性肝炎诊治专家共识》提出穿入现象是继上述三种特征性病理改变之后的另一种特征性的病理表现，对AIH的诊断及鉴别诊断有重要价值[1]。穿入现象，于1956年由Humble等首次提出，是指一个活细胞进入另一个活细胞的现象；与传统的“吞噬”概念明显不同，穿入是发生在两个活细胞之间，而吞噬是指吞噬已经死亡的细胞或其碎片的生理过程[2]。目前研究显示，穿入可发生于肿瘤细胞之间、免疫细胞与肿瘤之间或者免疫细胞和正常细胞之间[3]。Sandilands等[4]研究发现，淋巴细胞可穿入体外培养的人肝细胞，后续研究陆续发现穿入现象可见于自身免疫性肝炎、药物性肝炎、病毒性肝炎等[5-7]。2008年AIH简化诊断标准中将细胞穿入现象作为AIH组织学表现之一[6，8]，2015年我国《自身免疫性肝炎诊治专家共识》也提出穿入现象在AIH诊断及鉴别诊断中的价值，揭示了穿入现象在AIH中的重要地位，但穿入现象在AIH中的临床意义及价值仍不明确。本研究致力于阐述AIH中，细胞穿入现象的临床价值及意义。

资料和方法

一、标本来源和主要试剂

收集2008年至2015年在南通市第三人民医院及上海交通大学医学院附属仁济医院，行肝穿刺组织病理学检查的AIH患者，共计75例，其中男性12例，女63例。AIH的诊断标准参照1999年修订的自身免疫性肝炎积分系统，所有患者均为确定性诊断，评分≥18分。苏木素染色液及伊红染液购自上海研域化学试剂有限公司。

二、苏木素-伊红染色法

肝穿刺标本经过4%甲醛溶液固定后，石蜡包埋切片至4 μm厚；常规脱蜡水化，随后经过苏木素染色液及伊红染液浸染，透明后，中性树胶封片，显微镜下观察并统计。

三、 统计学分析

计量资料使用均数±标准差表示，组间比较应用非参数检验；计数资料使用n(%)表示，组间比较使用χ2检验。应用Graphpad prism 6行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、自身免疫性肝炎患者肝组织病理情况分析

共收集75例AIH患者，其中男性12例，女性63例，男女发病率近1:6，平均发病年龄49.7岁。对肝穿刺活检病理组织行Ishak评分系统评分。根据炎症评分高低将患者分为3个等级,分别为<6分、6～12分以及>12分。<6分27例，6～12分4例，>12分7例。根据纤维化程度不同将患者分为2个等级，≤2分以及≥3分，分别为34和41例患者。

二、AIH患者中主要以淋巴细胞穿入肝细胞为主

在AIH患者肝组织中，细胞穿入主要是发生在淋巴细胞与肝细胞之间，被淋巴细胞穿入的肝细胞胞质嗜伊红染色，提示肝细胞可能进入凋亡前期，即将发生细胞凋亡(图1)。75例AIH患者中43例(57.3%)发生淋巴细胞穿入肝细胞，提示淋巴细胞穿入肝细胞现象在AIH中较为常见。

AIH患者穿入现象

三、自身免疫性肝炎中，淋巴细胞穿入肝细胞的临床意义

75例AIH患者中Ishak评分<6分共27例，8例(29.6%)发生淋巴细胞穿入肝细胞；6～12分共41例患者，28例(68.3%)发现穿入现象；>12分共7例，肝组织中均发现淋巴细胞穿入肝细胞现象，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。该结果提示在AIH患者中，随着肝内炎症逐渐加重，淋巴细胞穿入肝细胞的发生比率也明显增加。进一步分析肝纤维化与穿入现象之间的关系。根据Ishak评分系统将AIH患者分为轻度纤维化及明显纤维化两组，≤2分为轻度纤维化组，不会出现P-P纤维桥接；而≥3分时视为明显纤维化组，肝内至少出现P-P纤维桥接，甚至出现肝硬化等严重改变。结果显示34例轻度肝纤维化患者中，12例(35.3%)肝组织内发生淋巴细胞穿入肝细胞现象；而41例明显肝纤维化患者组中，31例(75.6%)发现淋巴细胞穿入肝细胞现象，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

四、穿入现象与界面性肝炎、玫瑰花结、浆细胞浸润之间的关系

AIH特征性的病理学改变主要包括界面性肝炎、玫瑰花结以及浆细胞浸润三个方面。2008年国际自身免疫性肝炎小组制定的简化标准中提及穿入现象是AIH的表现之一，那么它与传统的AIH病理学特征之间是否存在相关呢？将所有AIH患者分为二组，分为无穿入现象组(n=32)及有穿入现象组(n=43)，结果显示在无穿入组患者中肝内界面性肝炎(0.91±0.34)相对较轻，而在有穿入现象组肝内界面性肝炎明显加重(1.84±0.27)，差异有统计学意义(P<0.01)；分析两组患者间浆细胞浸润是否存在差异，未发现穿入组患者中30例(93.8%)发现浆细胞，而穿入组中42例(97.7)发现浆细胞，统计学分析两组间浆细胞浸润无差异(P>0.05)；进一步分析有无穿入现象组间玫瑰花结发现率是否存在差异，结果显示无穿入组中4例(12.5%)发现玫瑰花结，而穿入组患者中11例(25.6%)发现玫瑰花结，结果分析显示两组患者肝组织中玫瑰花结发现率有统计学差异(P<0.05)。

讨　　论

1925年，Lewis首次发现细胞进入细胞的现象，并将其定义为一个活细胞自发进入另一个活细胞的现象[9]，其与传统的“吞噬”概念完全不同，主要表现在以下二个方面，①发生的主题不同：穿入发生在两个活细胞间，而吞噬发生在活细胞与凋亡细胞/细胞碎片之间；②结局不相同：发生穿入的细胞仍能存活一段时间，可发生分裂，甚至可从宿主细胞中“逃脱”，而吞噬的结局是以消除凋亡细胞或细胞碎片为最终的结局[3]。目前研究显示，细胞进入细胞现象可以发生在多种类型细胞之间，而根据细胞类型的不同，分为两大类：①Emperipolesis(穿入)指两种不同细胞间的相互作用，如免疫细胞与肿瘤细胞之间；② Entosis主要适用于同种细胞之间，如肿瘤细胞之间。Emperipolesis这一概念是由Humble等[2]在研究淋巴细胞和其他细胞相互作用的过程中提出的。进一步的研究发现，淋巴细胞可穿入多种类型的细胞，如：巨核细胞、成纤维细胞和乳腺癌细胞等[10-12]。早在1978年，Sandilands等[4]报道了穿入现象在肝脏方面的研究，发现体外培养的淋巴细胞可穿入正常人肝脏细胞(张氏肝细胞)。最近研究发现，其他种类的淋巴细胞系也可穿入肝细胞，如人T淋巴瘤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞等[13]。在多种疾病中也存在穿入现象，例如自身免疫性贫血、实体肿瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病等[10，14，15]。穿入现象是肝脏炎症性疾病的一个重要病理学特征，在疾病的诊断及鉴别诊断方面具有一定的参考价值，在多种肝脏炎症性疾病如AIH、病毒性肝炎和药物性肝损伤中均可发生[5-7]，其中AIH的发现率明显高于其他肝脏炎症性疾病，提示穿入现象在AIH的诊断中有一定的价值。本研究发现，57.3%的AIH患者肝组织中有淋巴细胞穿入肝细胞现象，提示淋巴细胞穿入肝细胞是重要的病理学特征，可能是继玫瑰花结、浆细胞浸润、界面性肝炎之后成为AIH特征性的病理改变，在AIH的诊断及鉴别诊断中发挥重要作用。进一步的研究发现，在AIH中，发生穿入现象的宿主肝细胞胞质嗜伊红染色，提示宿主肝细胞已经发生早期凋亡，这可能是AIH患者肝组织中肝细胞损害的机制之一。

目前认为，AIH发病基础是机体免疫耐受被打破，自身反应性T细胞在肝脏局部聚集，造成器官特异的自身免疫性肝损害，而肝细胞是主要的靶细胞[16]。在AIH发病过程中，CD8、CD4阳性T细胞、浆细胞以及单核/巨噬细胞在汇管区浸润，引起界板处肝细胞损伤为主要特征[17]。白介素-17可通过促进肝细胞分泌白介素-6等细胞因子参与AIH的发病机制[18]。最近研究发现，AIH患者肝组织中发生穿入的细胞主要是CD8阳性T细胞[19]，而CD8阳性T细胞是AIH中主要的效应细胞，结合本研究发现发生穿入的宿主肝细胞发生早期凋亡，提示穿入现象可能在AIH肝细胞损伤的发病机制中发挥重要作用。

综上所述，AIH患者淋巴细胞穿入肝细胞较为常见，并且随着肝内炎症的加重，穿入现象发生逐渐增加，提示穿入现象可能在AIH的发病过程中发挥重要作用。进一步研究发现，穿入现象与界面性肝炎以及玫瑰花结的发生相关，随着穿入现象的出现，界面性肝炎加重，玫瑰花结的发生率也增加，提示穿入现象可能是AIH重要的病理学特征，是AIH发病过程中肝细胞损害的重要机制之一。

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(本文编辑：钱燕)

Clinical significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis

BIANZhao-lian,QINGang,CHENLin,SHAOJianguo,MIAOQi,MAXiong.

NantongThirdPeople'sHospital,NantongInstituteofLiverDisease, 99MiddleQingnianRoad,Jiangsu, 226006China. 2DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity，ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,shanghai, 200001ChinaCorrespondingauthor:

ObjectiveTo investigate the incidence and clinic significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis (AIH) patients in China. MethodsA histological evaluation by hematoxylin-eosin staining in all AIH patients was performed. Assessment of Ishak score was carried out for intrahepatic inflammation or fibrosis, as well as evaluation of interface hepatitis, plasma cell infiltration and rosette formation in the liver. Then the incidence of emperipolesis was analyzed statistically in patients with AIH. Furthermore, the relation of emperipolesis with intrahepatic inflammation or fibrosis and other pathological characteristics of AIH were analyzed. ResultsThe presence of emperipolesis was observed in 57.3% AIH cases which was with hepatocyte eosinophilic stained. The incidence of emperipolesis showed positive correlations with the aggravation of intrahepatic inflammation or fibrosis. Histologically, patients with emperipolesis had higher incidences of interface hepatitis and rosette formation as compared with patients without emperipolesis. ConclusionEmperipolesis might be an important pathological hallmark for AIH, which might even illustrate a novel mechanism of hepatocyte damage in AIH.

Emperipolesis; Autoimmune hepatitis; Interface hepatitis; Rosette

南通市科技局(MS22015105，HS2014061)；江苏省卫计委科技项目(H201453)

226006南通市第三人民医院南通市肝病研究所(卞兆连，秦刚，陈琳，邵建国)；上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科上海市消化疾病研究所(苗琪，马雄)

马雄，Email：maxiongmd@163.com

2016-07-16)