利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测333例肺结核患者痰标本的结果分析

林日文,李 静

(广东省惠州市结核病防治研究所检验科 516008)



·临床研究·

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测333例肺结核患者痰标本的结果分析

林日文,李 静△

(广东省惠州市结核病防治研究所检验科 516008)

目的 探讨采用利福平(RFP)耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)检测肺结核患者痰标本的结果并进行分析。方法 选择2015年1～12月该所就诊的肺结核患者痰标本333例，分别进行抗酸染色涂片镜检、Xpert MTB/RIF、传统罗氏培养法检测，使用Xpert MTB/RIF检测痰标本的结核分枝杆菌(MTB)和RFP耐药的敏感度和特异度，并与传统罗氏培养法检测结果进行一致性比较。结果 Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感度为93.6%，特异度为92.0%，2种方法进行Kappa检验，Kappa=0.82，具有良好的一致性；RFP耐药的敏感度和特异度分别为78.6%和93.4%，2种方法的Kappa=0.78，具有良好的一致性。结论 应用Xpert MTB/RIF检测肺结核患者痰标本，检测速度快，准确性高，快速获得患者是否耐药的结果，可指导临床准确用药，值得临床应用和推广。

肺结核； 利福平； Xpert MTB/RIF检测技术

我国属于全球22个结核病高负担国家之一，患者数据居全球第2位[1]。结核病疫情具有高患病率、高耐药率、高感染率的特点。广东地区人口流动性大，外来人口多，结核病疫情尤为严峻。目前结核病比较突出的问题是患者产生耐药性，治疗效果差。如何早期发现患者对抗结核药产生耐药性是临床面临的挑战。耐多药结核病是指至少对抗结核药物中异烟肼(INH)和利福平(RFP)产生耐药，由于90%的结核杆菌对RFP耐药同时也对INH耐药，因此RFP耐药被认为是耐多药的重要标志[2-3]。传统罗氏结核杆菌耐药检测法，需要的检测时间至少2个月，因为检测时间长，对患者的及时治疗和临床用药造成障碍，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)快速检测法则弥补了其不足。现检测111株结核分枝杆菌，并对RFP耐药情况进行总结分析，为临床提供科学依据和经验用药参考。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年1～12月在惠州市结核病防治研究所就诊的肺结核患者痰标本333例，年龄19～69岁，男170例，女163例，嘱患者清晨清理口腔后用力咳出深部浓痰，一式2份。进行涂片镜检，分别标记出涂片阴性和阳性的标本，采用Xpert MTB/RIF核酸检测和改良罗氏培养，培养阳性者进行药物敏感试验[3-4]。评价2种方法检测结核分枝杆菌(MTB)和RFP耐药的敏感度和特异度，并对2种方法结果的一致性进行比较。

1.2 仪器与试剂 使用珠海Baso公司生产的培养基和标准菌株HRV,抗结核药由华南制药生产，Xpert MTB/RIF核酸检测仪是美国Motyd公司生产，Cartridge反应盒由北京芬尼公司提供。

1.3 方法 Xpert MTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司Gene-Xpert 检测系统是一种半巢式定时荧光PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针、检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核及是否对RFP耐药(rpoB序列存在突变)。打开 Gene-Xpert 检测仪的电源开关，然后运行Gene-Xpert 操作软件，使用扫码器扫描反应盒正面的识别码。软件将全自动填写所需信息。点击“开始测试”，2 h出结果，可判读是否MTB感染及是否RFP耐药。MTB检出高度：CT<16，阳性级别高，定义为4+： MTB检出中度：16

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，0

2 结 果

2.1 Xpert MTB/RIF检测MTB效能分析 333例初诊患者痰标本进行涂片染色镜检，其中阳性111例，阴性222例，以罗氏培养法为标准，Xpert MTB/RIF涂片阳性患者检测MTB的敏感度为94.9%(93/98)，特异度为69.2%(9/11)；Xpert MTB/RIF涂片阴性患者检测MTB的敏感度为83.3%(10/12)，特异度为94.7%(199/210)；全部患者检测的敏感度93.6%(103/110)，特异度为92.0%(208/226)。2种方法进行Kappa检验，Kappa=0.82，具有良好的一致性。见表1。

表1 Xpert MTB/RIF检测MTB效能分析(n)

2.2 Xpert MTB/RIF检测痰标本对RFP耐药的结果分析 333例初诊患者痰标本进行涂片染色镜检，涂片阳性111例，涂片阴性222例，以罗氏培养法为标准，Xpert MTB/RIF涂片阳性患者检测RFP耐药的敏感度为72.7%(8/11)，特异度为98.0%(98/100)；Xpert MTB/RIF涂片阴性患者检测RFP耐药的敏感度为100%(3/3)，特异度为91.3%(200/219)。全部患者检测的敏感度为78.6%(11/14)，特异度为93.4%(298/319)。2种方法进行Kappa检验，Kappa=0.78，具有良好的一致性。见表2。

表2 Xpert MTB/RIF检测痰标本对RFP耐药的结果分析(n)

3 讨 论

肺结核发病例数逐年升高，每年新增患者130万例。传统罗氏固体培养法是目前常用的诊断耐药结核的方法，其结果可靠，是诊断耐药结核的金标准。但其耗时较长，平均 1～2 个月的操作时间易造成诊断延误，期间耐药结核患者无法得到有效化疗，容易导致获得性耐药、结核复发或切口处窦道形成[8]。因此，需开发或寻找快速、准确、安全的检测结核耐药性的分子药敏诊断技术。近年来，Xpert MTB/RIF受到国内外广泛关注和探讨，临床应用处于初级起步阶段。本研究Xpert MTB/RIF检测333例肺结核患者痰标本结果表明,Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感度为93.6%，特异度为92.0%，2种方法进行Kappa检验，Kappa=0.82，具有良好的一致性格；RFP耐药的敏感度和特异度分别为78.6%和93.4%，2种方法进行Kappa检验，Kappa=0.78，具有良好的一致性。

Xpert MTB/RIF 作为一种全新的结核病快速检测新方法，具有如下特点：(1)集成性：将样品准备、扩增、定量检测进行统一。(2)快捷性：拥有极速加热和制冷的能力，可在2 h内提供精确稳定的试验结果。(3)灵活性：可配置多个模块同时进行多种不同的检测，任何1个反应都可随时启动和终止。(4)易操作：系统软件实时监测 PCR 进行情况，一旦 PCR 完成自动给出试验结果。(5)安全性：独立并自成体系的一次性反应盒增加了设备的安全性。(6)精确性：多个光谱的光学检测可以提供准确的实时定量 PCR 结果[9-10]。

Xpert MTB/RIF 检测方法是全球结核病诊断和治疗方面的一个重要里程碑，为面临罹患结核病和耐药结核病危险的人群带来新希望。 耐药结核病常规疫情的监测不仅是临床用药和评价化疗的重要依据，也是流行病学和结核病工作的重要指标。结核分枝杆菌耐药，特别是对 RFP 耐药，比对 RFP 敏感的结核患者有更高的病死率。RFP 耐药非常广泛，且是耐多药的一个重要标志。MDR-TB 患者很难被治愈，将带来潜在 MDR-TB 的传染性。因此，结核分枝杆菌耐药性快速检测对结核患者的有效治疗至关重要，特别是 RFP 耐药性快速检测具有重要的临床意义。

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[4]Vadwaiv C,Bochme C,Nabeta P,et al.xpert MTB/RIF:a new pillar in diagnosis of extrapulmonary tuberculosis[J].Clin Microbial,2011,49(7):2540-2545.

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.041

A

1673-4130(2016)20-2901-02

2016-04-18

2016-07-21)

△通讯作者，E-mail：ldwt010203@126.com。