8种血液病患者人巨细胞病毒感染情况分析

徐 爽，吕晓丽，邹菊贤，杨文青，李锐成，沈建军，张惠中

(第四军医大学唐都医院临床实验与检验科，西安 710038)



·临床研究·

8种血液病患者人巨细胞病毒感染情况分析

徐 爽，吕晓丽，邹菊贤，杨文青，李锐成，沈建军，张惠中△

(第四军医大学唐都医院临床实验与检验科，西安 710038)

目的 探讨不同血液病患者人巨细胞病毒(HCMV)感染情况。方法 选取该院8种血液病患者共274例，采用实时荧光定量PCR法对患者血液或尿液进行HCMV DNA检测。结果 血液病患者感染率由高到低依次为急性淋巴细胞白血病(ALL，39.47%)、急性混合型白血病(AL，28.57%)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL，26.15%)、再生障碍性贫血(AA，20.34%)、骨髓异常增生综合征(MDS，14.29%)、慢性粒细胞白血病(CML，13.64%)、三系血细胞减少(0.40%)，19例非霍奇金淋巴瘤(NHL)未检出HCMV感染。274例患者总阳性率达13.87%，其中AL阳性率最高(23.02%)。肿瘤患者HCMV感染率高于非肿瘤患者，感染率分别为24.85%和13.76%，差异有统计学意义(χ2=4.339，P<0.05)。8种血液病患者HCMV DNA载量均值为 5.00×103IU/mL，最高达1.29×106IU/mL。结论 8种血液病患者存在不同程度的HCMV感染，且肿瘤患者较非肿瘤患者感染率更高。

血液病； 人巨细胞病毒； 实时荧光定量PCR

人巨细胞病毒(HCMV)属β疱疹病毒亚科，属广泛传播的机会致病病毒，在人群中血浆免疫球蛋白G(IgG)抗体阳性率为40%～100%[1]。免疫功能正常者初次感染后无症状，大部分病毒被免疫系统清除，少部分呈潜伏状态，但当抵抗力下降，潜伏病毒被重新激活，引起活动性感染甚至致死性损伤，其中血液系统是其感染的主要受累部位之一[2-3]。HCMV干扰造血功能，使造血细胞增殖和分化，导致间质性肺炎病死率高达80%以上[4-5]。近年来，分子生物学技术的发展为病毒感染诊断开辟了新途径，其中实时荧光定量PCR法因其灵敏、特异、光谱技术敏感及精确定量的特点得到广泛应用。该技术全程全封闭反应，从根本上解决PCR扩增产物污染问题，具有较高的灵敏度、特异度、精确性，高效率、污染小等特点，为临床及科研提供及时、准确、可靠的实验室数据[6]。现应用实时荧光定量PCR法检测8种血液病患者HCMV DNA，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月至2015年12月该院住院血液系统疾病患者274例，其中急性混合型白血病(AL)21例，慢性粒细胞白血病(CML)22例，急性淋巴细胞白血病(ALL)38例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)65例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)19例，三系血细胞减少36例，骨髓异常增生综合征(MDS)14例，再生障碍性贫血(AA)59例。

1.2 仪器与试剂 仪器为美国ABI-7500型实时荧光定量PCR扩增仪，人巨细胞病毒核酸检测试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司生产。

1.3 方法 (1)血液标本：抽取患者血液3 mL，4 000 r/min离心5 min，吸取血清100 μL置于0.5 mL无菌Eppendorf管内，加入等量DNA提取液振荡混匀，100 ℃恒温处理10 min，12 000 r/min离心5 min，上清液备用。(2)尿液标本：嘱患者用无菌生理盐水或洁净清水冲洗外阴部后留取初尿液(晨尿)于无菌尿杯中。(3)非血性尿标本：将尿液倒入无菌干燥管，14 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀中加无菌生理盐水，振荡混匀，14 000 r/min离心5 min，弃上清液留沉淀。(4)血性尿标本：将尿液倒入无菌干燥管，14 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀中加无菌去离子水振荡混匀，14 000 r/min离心5 min，弃上清液留沉淀，重复洗涤直至上清液清亮(去除红细胞)后留沉淀。向沉淀中加50 μL DNA提取液振荡混匀，100 ℃恒温处理10 min，12 000 r/min离心5 min，上清液备用。

1.4 基因扩增与结果判读 分别吸取样品DNA、质控品DNA和阳性定量参考品各2 μL于扩增管中，8 000 r/min离心1 min后上机扩增，每次扩增均设阳性、阴性对照和空白对照。扩增参数为93 ℃预变性120 s；93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s,10个循环；93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s,30个循环，55 ℃时采集荧光。根据阳性定量参考品扩增结果分析并调节基线和阈值，线性相关系数(r)>0.98。若增长曲线不呈S型或CT值等于30，则判定检测结果为阴性，若增长曲线呈S型且CT值小于30，结果为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数和百分比表示，组间比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 8种不同血液病患者HCMV DNA检测结果比较 274例患者HCMV感染56例，感染率20.44%。其中ALL患者感染率最高(39.47%)，其次为AL和ANLL(28.57%和26.15%)。274例患者共检测1 233例次，总阳性率达13.87%，其中AL、ALL、ANLL占阳性总例数的比例较高，分别为23.02%、17.80%、14.40%。

2.2 肿瘤患者和非肿瘤患者阳性率结果比较 CML、ALL、ANLL、AL、NHL共165例，HCMV感染41例，感染率24.85%；非肿瘤性血液病患者感染率为13.76%，差异有统计学意义(χ2=4.962，P<0.05)。见表1。

2.3 5种血液病患者HCMV DNA载量分析 同一疾病患者之间病毒载量差异较大，最高可达1.29×106IU/mL，5种血液病患者HCMV DNA载量不同，但均值为5.00×103IU/mL。见表2。

表1 肿瘤患者和非肿瘤患者阳性率结果比较

表2 5种血液病患者的HCMV DNA载量分析

3 讨 论

HCMV属于疱疹病毒科，是特异性DNA病毒，自首次分离后被证实是一种在人群中广泛存在的感染因子[7]。因HCMV在体内可感染T细胞、B细胞、NK细胞及单核细胞，进一步造成免疫抑制，因此免疫功能低下者较健康者更易感染。随着现代生物医学的发展，造血干细胞移植取得长足进步，尤其是在血液恶性疾病的危险分期和分层治疗中得到广泛应用，较大改善疾病预后，但移植后细胞免疫和体液免疫功能下降，致使患者易发生病毒(单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)感染，其中HCMV感染发生率较高[8]。目前，国内外对HCMV致病的研究多集中于新生儿及器官移植患者，实际上多数血液病同样会对机体免疫系统造成损害，导致机体免疫功能下降，从而诱发HCMV 再次活化[9]。

本研究结果显示，274例患者HCMV感染者56例，感染率20.44%，其中ALL患者感染率最高，达39.47%，其次为AL，占28.57%，可能与HCMV在体内易感染T细胞、B细胞及单核细胞，造成免疫抑制有关。本组AA患者HCMV感染率达21.53%，在8种疾病的阳性总例数中占20.34%。桂敏等[10]研究表明，HCMV活动性感染可使造血干细胞明显减少，引起造血衰竭，但因骨髓HCMV活动性感染导致部分再生障碍性白血病的发生，还是骨髓 HCMV活动性感染加重再生障碍性白血病，有待于进一步研究。本组274例患者共检测1 233例次，总阳性率达13.87%，其中ANLL所占比例最高，其次为AA和ALL，这一结果除了与HCMV易感免疫细胞造成免疫抑制有关，还可能与疾病的状态和监测时间间隔有关，提示合理的病毒检测策略对感染的控制至关重要。

Tabata等[11]研究表明，HCMV感染能刺激肿瘤细胞TGF-β1的产生和激活，逃避宿主的免疫应答，且在HCMV感染的不同组织中发现HCMV增加内皮细胞中整合蛋白αvβ6 的表达，从而进一步激活TGF-β1分泌，抑制宿主的免疫应答，促进肿瘤的发生和发展。本研究结果说明，肿瘤患者HCMV感染率(24.85%)高于非肿瘤患者(13.76%)，差异有统计学意义(χ2=4.962，P<0.05)，提示除与上述机制有关外，肿瘤患者免疫状态低于非肿瘤患者，因而更易诱发HCMV感染及其他机会病原体感染。此外，免疫功能低下者白血病发病率明显升高，一旦发病可使机体免疫功能进一步受损，减弱免疫系统对肿瘤细胞的免疫监视和抗感染能力，致使病毒活化和激活，进一步加重病情。

本研究结果显示，同一疾病患者之间病毒载量差异较大，最高数值可达1.29×106IU/mL，5种血液病患者HCMV DNA的载量不同，但均值多集中在5.00×103IU/mL。目前尚无明确定义合适的病毒载量判断感染的轻重。国外研究显示大于5.00×103IU/mL 具有较高的患HCMV风险[12]。国内也有研究显示HCMV DNA大于5.00×103IU/mL时病情转归均较差[13]。所以，及时监测并准确定量血液病患者HCMV DNA载量，可帮助临床及早治疗，缩短治疗时间，并为评估治疗方案的成功与否和耐药性的出现提供重要依据。

综上所述，不同血液病患者存在不同程度HCMV感染，且肿瘤患者较非肿瘤患者感染率更高，实时定量PCR法检测HCMV DNA具有快速、高灵敏度和特异度，有重要的临床应用价值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.049

A

1673-4130(2016)20-2915-03

2016-02-16

2016-04-18)

△通讯作者，E-mail：zhz328@ffmmu.edu.cn。