猪蓝耳病活疫苗生产工艺探索

赵辉 葛俊伟/东北农业大学动物医学院

秦立鑫 郭立权/哈药集团生物疫苗有限公司

猪蓝耳病活疫苗生产工艺探索

赵辉 葛俊伟/东北农业大学动物医学院

秦立鑫 郭立权/哈药集团生物疫苗有限公司

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称“蓝耳病”，自2006年的夏秋季节，我国陆续暴发一种以高热为典型症状的综合症，给全国养猪业带来巨大浩劫。2007年1月，确定变异猪蓝耳病病毒是猪“高热病”主要病原，并定名为高致病性猪蓝耳病 (Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)。该病是由 HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的一种急性高致病性疫病。该病仔猪发病率可达 100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。HP-PRRS同其他病毒性疾病一样，目前尚没有较为有效的治疗药物，除按传统的隔离、消毒、控制人员活动对该病进行控制外，重中之重就是要有安全、稳定、高效的疫苗进行正确的免疫接种。因此, 研制出安全、高效、生产工艺简单、成本较低而又适应市场需求的高致病性猪蓝耳病疫苗成为生产企业努力的方向。

本研究对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）的生产工艺关键环节进行探索。从细胞扩大培养时的传代比例、培养液血清浓度、毒种繁殖时的接毒量、培养液体积、病毒原液收获时间、半成品原液保存温度及保存时间等几方面参数对原液的病毒效价的影响，展开对比试验，最终确定最佳参数，为高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）的大批量生产提供参考，不但要保障疫苗产品的质量，更要大大降低疫苗的生产成本和生产人员的劳动强度。

一、试验方案

（一）确定Marc-145细胞传代比率试验。

将长满单层的Marc-145细胞弃去营养液，用分散液分散后按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5传代比例传代，确定生产时最适合的传代比率。

1∶2传代：将转瓶中分散好的Marc-145细胞加入已配制好的营养液，转瓶中加入2 000 ml培养液，将细胞摇匀后无菌分装到2个转瓶中。

1∶3传代：将转瓶中分散好的Marc-145细胞加入已配制好的营养液，转瓶中加入3 000 ml培养液，将细胞摇匀后无菌分装到3个转瓶中。

1∶4传代：将转瓶中分散好的Marc-145细胞加入已配制好的营养液，转瓶中加入4 000 ml培养液，将细胞摇匀后无菌分装到4个转瓶中。

1∶5传代：将转瓶中分散好的Marc-145细胞加入已配制好的营养液，转瓶中加入5 000 ml培养液，将细胞摇匀后无菌分装到5个转瓶中。

将转瓶置于37℃温室中进行恒温培养，观察细胞贴壁增殖状况，并做好记录。

（二）不同接毒量对比试验

取形成良好单层的Marc-145细胞培养瓶，分别按培养液总量的1%、2%、3%、4%接入毒种，充分吸附后，

加入1%犊牛血清的DMEM培养液1 000 ml（维持液），置37℃培养，每日观察并记录CPE，当CPE达到80%时收获，测定病毒原液的TCID50，综合考虑后，选出既能保证生产又能降低生产成本的最佳接毒量。

（三）培养液中不同血清含量的比较试验

取形成良好单层的Marc-145细胞培养瓶，按1%接入毒种，充分缓慢旋转吸附，然后加入不同含量犊牛血清为1%、2%、3%、4%的培养液，置37℃恒温旋转培养，每日观察记录CPE，CPE达80 %时，收获病毒液，分别测定TCID50。

（四）培养液的不同加入量对比试验

取形成单层的Marc-145细胞培养瓶，每次选择8瓶细胞生长状况大致相同的培养瓶，按培养液总量1%接入毒种，加入含1%犊牛血清的DMEM培养液，一组2瓶，各加入800 ml培养液，二组2瓶，各加入1 000 ml培养液，三组2瓶，各加入1 200 ml培养液，四组2瓶，各加入1 400 ml培养液，置37℃恒温旋转培养，当CPE达到80%时，收毒，取样，分别测定含毒原液的TCID50。

（五）不同收获时间对比试验

取形成良好单层的Marc-145细胞培养瓶，按培养液的1 %接入毒种，充分缓慢旋转吸附，然后加入含1%犊牛血清的培养液，分别于CPE达到70%、80%、90%收获病毒液，并详细记录收获时的培养时间。分别测定TCID50，以便选出最佳收毒时间。

（六）病毒原液不同保存温度和时长的对比试验

将收获的病毒原液，分成8组，使用灭菌西林瓶分装，湿毒保存，每瓶5ml，每组两瓶。分别储存于4℃、-20℃、-40℃、-70℃温度，保存0 d、5 d、15 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d，比较不同保存温度及保存时间对病毒液毒价的影响。

二、试验结果

（一）Marc-145细胞传代比率的确定

在Marc-145细胞传代时用胰酶-EDTA分散液，按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5传代比例传代培养。72 h观察，按1∶2比例传代细胞生长过于紧密，死细胞较多；按1∶3、1∶4比例传代的细胞长满单层，形态良好；按1∶5传代的细胞没有长满单层。72 h传代后又继续传代，连续传代4次，按1∶2比例得传代细胞生长依然过于紧密，细胞层较厚，死细胞较多；按1∶5比例的传代细胞仍未能长成符合要求的细胞单层；按1∶3、1∶4比例的传代细胞均能达到所需厚度，而且生长形态良好。

（二）确定不同接毒量对病毒增殖的影响

在培养条件相同的情况下，以CPE达80%左右时收获，测定原液病毒含量。试验数据表明，1%、2%的接毒量制备的原液病毒含量最高，并且原液效价非常稳定，CPE达80%左右收获时，培养时间也大致相同。

（三）培养液中不同血清含量的比较试验

试验数据表明，4种血清浓度均能很好的复制病毒，4种收获原液病毒含量相差不多，考虑到疫苗成本和以及血清含量增加所带来的安全性隐患等因素，所以在该疫苗生产时，选用了1 %血清浓度。

（四）培养液不同加入量的对比试验

试验数据表明，瓶装量为1 000 ml和1 200 ml的原液病毒含量测定结果相近，但考虑到确保细胞生长和病毒增殖过程中有足够的营养供应。在疫苗生产时，选用了1 200 ml瓶装量。

（五）病毒液不同收获时间的对比试验

在培养过程中，随时观察CPE变化，分别于CPE达70%、80%、90%以上时，收获病毒原液，测定TCID50，比较不同收毒时间对病毒原液毒价的影响。试验数据表明，以CPE达80%左右时，原液的病毒含量最高，即该疫苗的收获时间为接毒后56～58 h收毒为宜。

（六）不同保存温度和时间对病毒原液病毒含量的影响

不同保存温度和保存时间对病毒效价的影响非常明显。试验数据表明，4℃仅可以短期保存，不可用该温度长期保存该病毒原液。-80℃保存毒价效果最好，但对于大批生产的原液储存条件过于苛刻。-20℃保存毒价下降较为缓慢，可以作为长期储存条件。考虑生产成本和生产连续性，多采取4℃短期保存，快速冻干的生产工艺。

三、结论

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)在大批生产中，最适宜细胞传代比例为1∶4；接毒量为培养液总量的1%；细胞培养血清浓度为1%；制苗用病毒繁殖收获时间为细胞80%病变程度时，培养时间约为56～58 h收获；采用收获后快速冻干原则，特殊情况-20℃保存不得超过2个月。这样即可保证半成品原液的效价，又可以降低生产成本，节约劳动力，能够给蓝耳病疫苗的生产带来一定的工艺优化成效。