新疆南疆驴源H3N8亚型EIV NA基因序列分析

刘永宏，张路瑶，李飞，赵丽

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)



新疆南疆驴源H3N8亚型EIV NA基因序列分析

刘永宏，张路瑶，李飞，赵丽

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

【目的】明确新疆南疆驴是否感染EIV，及EIV NA基因特征。【方法】根据GenBank登录的EIV基因序列，设计合成1对引物，针对新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺进行EIV NA基因RT-PCR扩增、电泳分析、胶回收、测序及序列分析。【结果】中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株NA基因长1 413 bp，编码470个氨基酸。与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸同源性为75.2%～99.6%，与国内外参考毒株氨基酸同源性为80%～100%，与国内毒株、哈萨克斯坦毒株和印度毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一一个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位点个数和分布位置完全一致。【结论】新疆南疆存在驴感染EIV，可能为国内疫情的延续或周边国家传入。

驴；马流感病毒；H3N8亚型

0 引 言

【研究意义】马流行性感冒，简称马流感(Equine influenza, EI)，是由马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起马、驴和骡的一种高度接触性呼吸道传染病[1，2]，现发现该病毒还感染犬和猪[3，4]。世界动物卫生组织OIE将其列为法定报告动物传染病，我国将其列为三类动物疫病[5]。马流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒属(Influenza virus A)。目前A型流感病毒根据HA分为16个亚型(H1～H16)，而NA分为9个亚型(N1～N9)。从系统发育生物学角度分别对HA和NA基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了分析，所获结果也为上述分类提供了佐证[6]。EIV有2个亚型，分别是H7N7亚型EIV(即马甲1型)和H3N8亚型EIV(即马甲2型)[1，7，8]。马流感的频繁暴发，对养马业，尤其赛马业危害极其严重，已在世界范围内造成了巨大的经济损失。我国历史上至少发生4次马流感大流行，即1974年由H7N7亚型EIV引起的首次大流行，当时首先从新疆开始，然后向南向东传播蔓延至17个省(市)、自治区，自此之后H7N7亚型EIV在中国马群中再未分离到；1989～1990年，在吉林、黑龙江和内蒙古连续2次暴发马流感疫情；1992～1994年，我国西部、西北、华北和西南等地区马群中暴发马流感疫情；2007年，新疆、甘肃相继暴发了马流感疫情，并迅速蔓延传播到华北地区。后3次马流感疫情均由H3N8亚型EIV引起[9]。【本研究切入点】目前，新疆及新疆周边邻国存在马流感疫情[10-12]，这对当前新疆地区马属动物的威胁十分巨大。考虑新疆南疆特殊的气候环境和地域地貌因素，有必要深入研究。【拟解决的关键问题】研究对新疆南疆驴肺组织病料进行EIV核酸检测，并对EIV NA基因进行序列分析，为新疆南疆该病的防制提供依据，具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病料

33份驴肺组织病料，来自2015年新疆南疆地区2个驴屠宰点，-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

Trizol invitrogenTM(Code No.：15596-026)，购自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.：DRR019A)，PremixTaq® Version2.0(Code No.：D331A)和DNA Marker2000，购自宝生物工程(大连)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit(Code No.：DP209)，购自天根生化科技(北京)有限公司等。

1.1.3 引物

按照引物设计原则，利用Primer Premier5.0分子生物学软件，以GenBank数据库中国内外已发表的保守的马属动物H3N8亚型EIV和H7N7亚型EIV的NA基因全序列为参照设计特异性引物。引物序列为5ˊ-AGCAAAAGCAGGAGATTAAAATG-3ˊ，5ˊ-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCATT-3ˊ，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.4 参考毒株

国内外具有代表性的39个EIVNA基因全序列，均来源于GenBank数据库，列出毒株详细信息。表1

表1 参考毒株
Table1 Reference isolates

No．序号毒株名称StrainName登录号GenBankaccessionnumbersGenBank宿主Host备注Remarks1A/equine/Xinjiang/1/2015(H3N8)未登录donkey中国新疆南疆2A/equine/Yokohama/aq5/2011(H3N8)AB727556horse日本3A/equine/Santiago/77(H7N7)AY383757Equine智利4A/equine/Cordoba/18/1985(H3N8)CY032303Equine阿根廷5A/equine/Austria/421/1992(H3N8)CY032351Equine奥地利6A/equine/Switzerland/173/1993(H3N8)CY032359Equine瑞士7A/equine/Roma/5/1991(H3N8)CY032367Equine意大利8A/equine/Switzerland/1118/1979(H3N8)CY032383Equine瑞士9A/equine/Romania/1/1980(H3N8)CY032391Equine罗马尼亚10A/equine/SaoPaulo/1/1969(H3N8)CY032399Equine巴西11A/equine/Fontainbleu/1/1979(H3N8)CY032407Equine法国12A/equine/Berlin/1/1989(H3N8)CY032415Equine德国13A/equine/Uruguay/1/1963(H3N8)CY032423Equine乌拉圭14A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)CY032947Equine阿尔及利亚15A/equine/Johannesburg/1/1986(H3N8)CY032955Equine南非16A/equine/SaoPaulo/4/1976(H7N7)CY036881Equine巴西17A/equine/Uruguay/1063/1976(H7N7)CY036889Equine乌拉圭18A/equine/Argentina/1/1977(H7N7)CY036897Equine阿根廷19A/equine/NewMarket/nasalwash1/1979(H3N8)CY096901Equine美国20A/equine/Prague/1/1956(H7N7)CY096909Equine捷克21A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)CY096917Equine日本22A/equine/InnerMongolia/8/2008(H3N8)EU794529horse中国23A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)EU794537horse中国24A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)EU794545horse中国25A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)EU794577donkey中国26A/equine/Lonquen/1/2006(H3N8)EU926630Equine智利27A/equine/Newmarket/1/1993(H3N8)FJ375222horse联合王国28A/Equine/Jilin/1/89(H3N8)FLANAJILINhorse中国29A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)GU571145Equine中国30A/equine/Colorado/10/2007(H3N8)HQ993105Equine美国31A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)JN674068horse印度

表1 参考毒株

续表1

Table1 Reference isolates

1.1.5 仪器

PCR仪(TC-5000, Bibby scientific Ltd)，小型高速冷冻离心机(R134a, Hermetically sealed refigeration system)，电泳仪(DYY-12，北京市六一仪器厂)，紫外分析仪(JY02S, 北京君意东方电泳仪设备有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取

从驴肺组织病料中提取总RNA，按Trizol invitrogenTM试剂盒说明书操作。

1.2.2 RT-PCR反应

总RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，利用实验室已合成的NA基因特异性引物，进行一步法扩增NA基因片段，退火温度均为54℃。

1.2.3 PCR产物纯化回收

取NA基因片段RT-PCR扩增产物电泳切胶后，按照TIANgel Midi Purification Kit试剂盒说明进行回收纯化。

1.2.4 测序

将纯化产物标记后送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序引物为NA基因扩增引物。

1.2.5 序列分析

搜索GenBank数据库中部分EIV NA基因全序列和该实验获得的NA基因全序列，用DNAStar软件EditSeq程序将其核苷酸和氨基酸序列分别保存为*.Seq和*.Pro格式文件，应用该软件MegAlign程序Clustal W法进行比对，然后在Veiw菜单中Sequence Distance和Phylogenetic Tree提取序列比对结果和进化树图。同时结合毒株时空分布，分析中国新疆南疆地区驴源EIV来源及演变特征。

2 结果与分析

2.1 EIV NA基因片段RT-PCR扩增结果

研究的33例样品，根据NA基因特异性引物RT-PCR扩增相应基因片段，结果显示其中2份病料为阳性，扩增片段约1.4kb，与预期扩增长度一致，阴性对照成立。图1

2.2 中国新疆南疆EIV NA基因核苷酸序列分析

经对其NA基因测序及序列比对分析，中国新疆南疆驴源EIV为H3N8亚型，命名为A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)，其NA基因包括一个完整阅读框架长1 413 bp。与GenBank数据库中唯一一个驴源NA全基因毒株，即中国新疆2007年毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)核苷酸同源性为99.4%；与中国毒株核苷酸同源性最高的为2007年中国新疆马源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)，同源性为99.6%；与中国毒株核苷酸同源性最低的为1989年中国吉林A/Equine/Jilin/1/89 (H3N8))株，同源性为75.2%；国外毒株与其核苷酸同源性最高的毒株为印度2008年毒株A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)，同源性达99.2%；国外毒株与其核苷酸同源性最低的毒株为阿尔及利亚A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)株，同源性为90.2%。以上所述均为H3N8亚型EIV毒株，与H7N7亚型EIV毒株核苷酸同源性为44.0%～45.7%。

根据NA基因核苷酸全序列基因进化树显示，囊括22个国家的40个EIV毒株被划分2个大的分支，一个分支为H3N8亚型EIV毒株，另一个分支为H7N7亚型EIV毒株，A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)被划分到H3N8亚型分支。该研究毒株与2007年新疆1个马源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)和1个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)，以及2007年华北1个毒株A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)在一个小的进化分支内。其次，与2013年中国徐州A/equine/Xuzhou/01/2013(H3N8)株、2012年哈萨克斯坦A/equine/Kostanay/09/2012(H3N8)株、2008年印度A/equine/Mysore/12/2008(H3N8)株和2008年中国广西A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株进化关系也非常近。图1

M：Maker；1：阴性对照；2～3：NA基因

2.3 中国新疆南疆EIV NA基因氨基酸序列分析

中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的NA基因编码470个氨基酸，与GenBank数据库中唯一一个驴源NA全基因毒株，即中国新疆2007年毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)氨基酸同源性为99.6%；与国内毒株氨基酸同源性最高的为2008年中国内蒙古A/equine/Inner Mongolia/8/2008(H3N8)株、2007年新疆A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)株和2007年中国华北A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)株，同源性均为100%；与中国毒株氨基酸同源性最低的为1989年中国吉林A/Equine/Jilin/1/89(H3N8)株，同源性为80%；国外毒株与其氨基酸同源性最高的毒株为哈萨克斯坦2012年毒株A/equine/Kostanay/09/2012(H3N8)，同源性达99.1%；国外毒株与其氨基酸同源性最低的毒株为阿尔及利亚A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)株，氨基酸同源性为88.7%。以上所述均为H3N8亚型EIV毒株，与H7N7亚型EIV毒株氨基酸同源性为38.6%～39.0%。

图2 马流感病毒毒株NA基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene of EIV isolated

中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)NA氨基酸序列含有7个糖基化位点，分别位于N39ET、N54ET、N67TS、N84NT、N144GT、N293WT和N398WS位，与毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位点个数和分布位置均相同。

注：糖基化是糖链以N-糖苷键结合在Asn(天冬酰胺)-X-Thr/Ser的Asn残基上，X为除脯氨酸外的任一氨基酸残基。

3 讨 论

通过对新疆南疆驴肺组织病料进行EIV核酸检测及NA序列分析，证实中国新疆南疆目前驴体内存在H3N8亚型EIV。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)与中国新疆2007年驴源毒株核苷酸同源性为99.4%；与中国毒株核苷酸同源性最高的为2007年中国新疆毒株，达99.6%；与国外毒株核苷酸同源性最高的为印度2008年毒株，同源性达98.9%。HA基因核苷酸全序列基因进化树也显示，研究毒株与新疆2007年1个马源毒株和1个驴源毒株，以及2007年1个中国华北毒株在一个小的进化分支内。其次，与2013年中国徐州株、2012年哈萨克斯坦株、2008年印度株和2008年中国广西株进化关系也非常近。由上述结果分析得出，新疆南疆驴源毒株可能为早些时间中国EIV毒株的延续或周边国家毒株跨境或季风原因传播扩散。

NA蛋白由基因组片段6编码，是马流感病毒另一个主要表面抗原，其成分为整体膜糖蛋白。寡糖链对NA的功能有重要影响，如果缺乏糖基化，NA结构的稳定性和酶活性都会受到影响[8，13，14]。中国新疆南疆驴源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)NA氨基酸序列含有7个糖基化位点，与唯一的一个驴源毒株糖基化位点个数和分布位置完全一致。

H3N8亚型EIV能从马跨越种间障碍传播给狗和猪[3-4]，是因为H3N8亚型EIV属于A型流感病毒，可感染多种哺乳动物，并在宿主间进行广泛传播[15-17]。马业相关单位重视对马属动物马流感疫情的监测，以及哺乳动物马流感病毒的监测，为马业的健康长期发展提供保障。

4 结 论

根据NA基因RT-PCR扩增结果及其所得序列分析结果可知，新疆南疆存在驴感染EIV；根据NA基因遗传演化分析结果显示，新疆南疆现存的驴源EIV为国内疫情的延续或周边国家传入。

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Fund project:Supported by NSFC(31460655)and Open project of key laboratory of Tarim animal husbandry science and technology of Xinjiang Production & Construction Corps(HS2014011)

Sequence Analysis of NA Gene of H3N8 EIV of Donkey in Southern Xinjiang

LIU Yong-hong, ZHANG Lu-yao, LI Fei, ZHAO Li

(College of Animal Science, Tarim University / Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science andTechnologyofXinjiangProduction&ConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 In order to clarify whether donkeys were infected with EIV in Southern Xinjiang and the characteristics of NA gene of EIV.【Method】According to the sequence of NA gene in GenBank, we designed and synthesized 1 pair of primers. The NA gene was obtained by RT-PCR for the suspected cases infected with EIV in Southern Xinjiang. Then the electrophoresis analysis, gel recovery, sequencing and sequence analysis were utilized.【Result】The results showed that HA gene of A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8) strain was 1,413 bp in length, encoding 470 amino acids. The homology of the nucleotide sequence and the amino acid sequence with domestic and foreign reference strains was 75.2%～99.6%% and 80%～100% respectively. The strain with the Chinese strains 、 Kazakhstan strain India strain in the same evolutionary branching. Amino acids of glycosylation site was completely consistent with A/donkey/Xinjiang/5/2007 (H3N8), the only one strain from donkey in the GenBank database.【Conclusion】There is a donkey EIV infection in Southern Xinjiang, which may be a continuation of the domestic epidemic or might be introduced from neighboring countries. This study has certain significance for the disease prevention and control in Southern Xinjiang.

donkey; EIV; H3N8 subtype

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.024

2016-03-11

国家自然科学基金项目(31460655)；兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(HS2014011)

刘永宏(1981-)，男，内蒙古武川人，副教授，博士，研究方向为家畜病理学，(E-mail)lyhdky@126.com

赵丽(1982-)，女，内蒙古鄂尔多斯人，副教授，研究方向为动物传染病与免疫病理学，(E-mail)zhaolidky@126.com

S855.3

A

1001-4330(2016)08-1539-07