绵羊副结核病的病原学检测与分析

吴建勇，吴星星，杨学云，李建军，王登峰，金映红，王光雷，王治才

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，乌鲁木齐 830063)



绵羊副结核病的病原学检测与分析

吴建勇1，吴星星2，杨学云1，李建军1，王登峰1，金映红1，王光雷1，王治才1

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，乌鲁木齐 830063)

【目的】确诊一例疑似绵羊副结核分枝杆菌感染的病原学特征。【方法】将送检病料(肠系膜淋巴结)涂片、抗酸染色后进行显微镜观察；同时，提取肠系膜淋巴结组织DNA，采用PCR扩增副结核分支杆菌的IS900基因及亚型分型基因，并进行序列测定与分析。【结果】组织涂片染色镜检后可见抗酸染色阳性菌株；IS900基因及亚型分型基因的检测和序列分析结果表明，目标菌株为Ⅱ型(牛型)副结核分支杆菌。【结论】采用镜检及分子检测等手段确定从所送检绵羊肠系膜淋巴结组织为Ⅱ型(牛型)副结核分支杆菌感染样本。

副结核分支杆菌；绵羊；病原检测；序列分析

0 引 言

【研究意义】副结核病(Paratuberculosis)又称为约内氏病(Johne's disease)，是一种由副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis)引起牛羊等多种动物以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚为特征的慢性消耗性传染病，其慢性或隐性感染常常给家畜养殖业带来了较大经济损失[1-2]。其中，羊副结核病在澳大利亚、新西兰、南非、智利、加拿大、西班牙、希腊、挪威、法国、土耳其等国均有文献报道；与牛副结核临床症状不同的是，羊副结核大多呈隐性感染，其临床多表现为渐进性消瘦、不耐运动并带有软性粪便，极易被误诊或忽视[3]。【前人研究进展】副结核分支杆菌作为一种胞内寄生的抗酸染色阳性菌，主要通过消化道感染易感动物，且以幼畜最为易感。羊只自然感染到出现临床症状通常需要12个月以上潜伏期[4]。通过胞内寄生，该菌可以损伤宿主免疫系统，使得宿主对其它病原的易感性增高，从而导致机体进一步消瘦与虚弱[4]。在细菌学分类上，一般将该菌分为3个亚型：Ⅰ型(羊型)、Ⅱ型(牛型)以及Ⅲ型(生物中间型)，不同亚型培养特征不尽相同[5]。其中，牛型菌株的易感动物较多，毒力也较强，体外培养时间一般为8～12周，培养物为乳白色菌落；而羊型菌株对羊以外的其他宿主致病性较弱，培养物的菌落呈黄色，体外培养时间需要半年以上，培养难度较大，很难分离获得该菌。【本研究切入点】通过肠系膜淋巴结组织涂片及抗酸染色、分子鉴定和亚型分析，可以确定感染副结核分支杆菌的亚型，这对该菌的分离培养极为重要[6-7]。【拟解决的关键问题】对送检的疑似副结核感染羊肠系膜淋巴结进行涂片、染色、镜检、分子鉴定及序列分析，以确定其病原学特征，为该病的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

副结核分支杆菌参考株(ATCC BAA-968)购自美国菌种保藏中心，复苏和传代培养按推荐方法进行，提取其基因组DNA作为此次试验的阳性对照。

1.1.2 试 剂

QIAamp DNA mini Kit购自QIAGEN公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；2×GoTaqgreen master mix、pGEM-T easy Vector购自Promega公司；100 bp DNA Ladder、IPTG、X-Gal购自生工生物工程(上海)有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 引 物

副结核分枝杆菌IS900分子鉴定引物(Primer90、Primer91)[8]、亚型分析引物(DMC529、DMC531、DMC533)[9]，以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。表1

表1 所用引物Table 1 Primers of this article

1.1.4 样品来源

2015年7月，病羊来自新疆某一养羊户。病羊年龄为4～5岁，表现为体况消瘦及腹泻症状；剖检后可见肠系膜淋巴结肿大，初步判断为疑似副结核分支杆菌感染。采集绵羊肠系膜淋巴结作为试验研究的目标样品。

1.2 方 法

1.2.1 病料的抗酸染色

将肠系膜淋巴结涂片、固定，参考《中国结核病防治规划实施工作指南》推荐的抗酸染色法染色，镜检，并采用副结核分支杆菌参考菌株作为对照，判断送检样本是否存在抗酸染色阳性菌株。

1.2.2 肠系膜淋巴结组织样品DNA的提取

取约100 mg淋巴结组织，加入液氮研磨后分装成一式三份，采用QIAamp DNA mini Kit提取组织基因组DNA，具体操作按试剂盒说明书介绍的方法进行。

1.2.3 副结核分支杆菌IS900基因的分子检测

以Primer90、Primer91为引物对IS900基因进行PCR扩增，反应程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 3 min；30个循环后72℃ 7 min。扩增产物进行胶回收后克隆至pGEM-T easy载体中，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选后，在每平板上挑选3～5个阳性克隆提取质粒进行序列测定、比对与分析。

1.2.4 副结核分支杆菌的亚型鉴定

以DMC529、DMC531、DMC533为引物对副结核分支杆菌的亚型进行PCR鉴定，反应程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；30个循环后72℃ 7 min。扩增产物进行胶回收后连接pGEM-T easy载体，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选后，每平板上挑选3～5个阳性克隆提取质粒进行序列测定、比对与分析。

2 结果与分析

2.1 病菌的染色镜检结果

通过对送检的绵羊肠系膜淋巴结组织样本进行涂片、抗酸染色及显微镜检查后可见肠系膜淋巴结组织染色背景为蓝色，其间有红色、不规则的细短杆菌(图1 A)，与副结核分枝杆菌参考菌株抗酸染色特征及形态相似(图1 B)，判断为抗酸染色阳性菌。图1

注：A：绵羊肠系膜淋巴结组织涂片抗酸染色结果图；B：副结核分枝杆菌参考菌株(ATCC BAA-968)抗酸染色结果

Note: A: Acid-fast Staining results of smear of sheep mesenteric lymph node; B: Acid-fast Staining results ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisreference strain (ATCC BAA-968)

图1 抗酸染色、显微镜观察结果

Fig.1 Results of microscopic examination after acid-fast staining

2.2 肠系膜淋巴结组织提取DNA中副结核分支杆菌基因片段检测

将提取肠系膜淋巴结组织基因组DNA编号为MAPxj-5(sheep)，采用副结核分支杆菌特异性引物进行副结核分支杆菌特异性基因IS900的扩增，结果显示，从目标样本中扩增得到400 bp左右的目的片段，与预期大小一致。图2

注：M：Marker 100 DNA ladder marekr；1～2：副结核分枝杆菌参考菌株ATCC BAA-968 DNA；3～5：疑似病例肠系膜里巴结组织DNA；6：空白对照

Note: M: Marker 100 DNA ladder marekr; 1-2: Amplificated result of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis reference strain (ATCC BAA-968); 3-5: Amplificated result ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node; 6: Blank control

图2 病羊绵羊肠系膜淋巴结DNA中副结核分支杆菌的PCR检测结果

Fig.2 Detection results ofMycobacteriumparatuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node by PCR

将所扩增的目的基因IS900连接T载体并进行序列测定与分析，结果表明其序列长度为400 bp。Blast搜索结果显示，该序列与GenBank中的CP005928.1、AF416985.1、AF305073.1、AE016958.1、S74401.1、AJ250015.1、AF250016.1、X16293.1、FJ775181.1等序列同源性在99.0%以上；用Clustal W方法分析，同源性均在99.2%以上，进一步表明所扩增的样品种含有副结核分枝杆菌。图3

图3 病料淋巴结副结核分枝杆菌IS900基因序列的相似性和遗传偏离Fig.3 Identity and divergence of IS900 gene inMycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains

2.3 肠系膜淋巴结组织DNA中副结核分支杆菌的亚型鉴定及序列比对

进一步采用DMC529、DMC531、DMC533引物对所提取的组织基因组DNA进行副结核分支杆菌基因Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ型特异性基因扩增。结果显示，从目标样品中成功扩增出310 bp的目的片段，该片段与Ⅱ型菌株亚型分型基因片段的预期大小一致。图4

注：M：Marker 100 DNA ladder marekr；1～2：副结核分枝杆菌参考菌株(ATCC BAA-968)扩增结果；3～5：疑似副结核分枝杆菌肠系膜里巴结组织DNA扩增结果；6：空白对照

Note: M: Marker 100 DNA ladder marekr; 1-2: Amplificated result ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisreference strain (ATCC BAA-968); 3-5: Amplificated result of MMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node; 6: Blank control

图4 绵羊肠系膜淋巴结样品副结核分支杆菌亚型鉴定结果

Fig.4 Subtype identification results ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisfrom sheep mesenteric lymph node

对亚型基因片段进行克隆及基因序列测定，结果表明其序列长度为310 bp；参考Collins等人[9]公布的Ⅰ型、Ⅱ型序列进行比对分析，可见试验所扩增的基因与Ⅱ型基因序列相似性为100%，从而确定检测样品中的目标菌株为II型副结核分枝杆菌。图5

注：Ⅰ：Ⅰ型(羊型)副结核分支杆菌序列；Ⅱ：Ⅱ型(牛型)副结核分支杆菌序列；MAPxj-5

Note: Ⅰ:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosistype Ⅰgene sequence; Ⅱ:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosistype Ⅱ gene sequence

图5 副结核分支杆菌不同亚型DMC基因序列比对结果

Fig.5 Sequence Alignment of different subtype DMC gene fromMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis

3 讨 论

副结核病是一种重要的人畜共患病，我国农业部将其列为二类动物疫病病种名录。该病慢性、隐性感染给全球养羊业带来了一定的经济损失，也给人带来潜在的健康威胁。目前，国外已有商品化的副结核分支杆菌抗体检测试剂盒用于牛副结核病的检测；但绵羊副结核病ELISA抗体检测方法经过20多年的研究，仍未解决敏感性与特异性问题，还未能应用于临床诊断与检测。对于羊副结核分枝杆菌感染多采用传统的细菌分离培养或分子生物学检测等技术手段进行诊断。由于羊感染副结核分枝杆菌后潜伏期长、临床症状不明显，仅仅依靠细菌分离培养进行诊断往往不能及时发现和隔离病畜，加大了该病在羊群中传播和进一步扩散的风险。

上世纪90年代，我国张恒轩[10]、马勋等[11]从临床特征、剖检、涂片镜检等方面判断新疆的马鹿以及小尾寒羊可能存在副结核病；近年来，国内多个单位的研究人员也开展了于奶牛[12]、牦牛[13]、梅花鹿[14]等牲畜副结核分支杆菌抗体检测的研究，确定了我国存在副结核病抗体阳性动物，但对于患畜病原的分子检测和亚型分析鲜有报道。研究以美国菌种保藏中心引进的参考菌株为标准，提取疑似副结核分枝杆菌感染组织DNA，用PCR扩增、序列测定与分析方法，对疑似病例中的病原进行了种及亚型水平鉴定，确定了所检病例属于II型(牛型)副结核分枝杆菌感染。该结果与美国Collins等[15]报道的非接触牛、鹿的绵羊以Ⅰ型副结核分支杆菌感染为主的报道不同[15]。试验从显微镜检查、分子鉴定等进一步证明了新疆绵羊种存在II型(牛型)副结核分枝杆菌感染，而开展羊源副结核分支杆菌的分离培养及其追踪溯源是下一步亟待开展的工作。

4 结 论

研究通过绵羊肠系膜淋巴结组织涂片、抗酸染色、显微镜观察、副结核分枝杆菌特异性基因的分子检测及亚型分型鉴定等手段，确定了送检病料为II型(牛型)副结核分枝杆菌感染样本，从病原学角度进一步验证了新疆羊群中存在副结核分枝杆菌感染。研究为绵羊副结核分枝杆菌感染的病原学分子检测提供了技术手段，也为下一步开展副结核分枝杆菌的分离鉴定及其追踪溯源提供了基础。

References)

[1]Fiorentino, M. A., Gioffré, A., Cirone, K., Morsella, C., Alonso, B., & Delgado, F., et al. (2012). First isolation of mycobacterium avium, subsp. paratuberculosis, in a dairy goat in argentina: pathology and molecular characterization.SmallRuminantResearch, 108(1-3):133-136.

[2]Lombard, J. E. (2011). Epidemiology and economics of paratuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 27(3):525-535.

[3]Windsor, P. A. (2015). Paratuberculosis in sheep and goats.VeterinaryMicrobiology, 181(1-2):161-169.

[4]Robbe-Austerman, S. (2011). Control of paratuberculosis in small ruminants.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 27(3):609-620.

[5]Juan, L. D., lvarez, J., Romero, B., Bezos, J., Castellanos, E., & Aranaz, A., et al. (2006). Comparison of four different culture media for isolation and growth of type ii and type i/iii subsp. strains isolated from cattle and goats.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 72(9):5,927-5,932..

[6]Travería, G. E., Zumarraga, M., Etchechoury, I., Romano, M. I., Cataldi, A., & Pinedo, M. F., et al. (2013). First identification of mycobacterium avium paratuberculosis sheep strain in argentina.Brazilianjournalofmicrobiology: [publicationoftheBrazilianSocietyforMicrobiology],44(3):897-899.

[7]Robbe-Austerman, S. (2011). Control of paratuberculosis in small ruminants.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice,27(3):609-620.

[8]Naser, S. A., Collins, M. T., Crawford, J. T., Valentine, J. F., Naser, S. A., & Collins, M. T., et al. (2009). Culture of mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (map) from the blood of patients with Crohn`s disease: a follow-up blind multi center investigation.OpenInflammationJournal, 2(1):22-23.

[9]Collins, D. M., De, Z. M., & Cavaignac, S. M. (2002). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains from cattle and sheep can be distinguished by a pcr test based on a novel DNA sequence difference.JournalofClinicalMicrobiology, 40(12):4,760-4,762.

[10]张恒轩, 张建基, 龚嘉林, 等. 新疆马鹿感染副结核分枝杆菌的调查研究[J]. 特产研究,1994,(2): 16-17.

ZHANG Heng-xuan, ZHANG Jian-ji, GONG Jia-lin, et al. (1994). Investigation of Mycobacterium paratuberculosis in Xinjiang Wapiti [J].SpecialWildEconomicAnimalandPlandResearch, (2):16-17. (In Chinese)

[11]马勋, 张高轩, 田晶华, 等. 新疆绵羊副结核分枝杆菌病的诊断(简报)[J]. 石河子大学学报(自然科学版),1999,3(1).

MA Xun, ZHANG Gao-xuang, TIAN Jing-hua, et al. (1999). The Diagnosis of Mycobacterium Paratuberculosis of Sheep in Xinjiang [J].JournalofShiheziUniversity(NaturalScienceEdition), 3(1). (In Chinese)

[12]韩猛, 张亮, 王基隆, 等. 山东省规模化奶牛场结核病与副结核病流行病学调查研究[J]. 中国农学通报, 2014,30(14):10-13.

HAN Meng, ZHANG Liang, WANG Ji-long, et al. (2014). Epidemiological Investigation of Large-scale Dairy Farm on Tuberculosis and Paratuberculosis in Shandong Province [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 30(14):10-13.(In Chinese)

[13]汪小强, 韩照清, 刘鑫宇, 等. 西藏部分地区牦牛副结核病血清流行病学调查[J].中国奶牛, 2015,(14):63-65.

WANG Xiao-qiang, HAN Zhao-qing, LIU Xin-yu, et al. (2015). Seroprevalence of Paratuberculosis in Yaks in Some Regions of Tibet, China [J].ChinaDairyCattle, (14):63-65. (In Chinese)

[14]付志金, 宋战昀, 冯新, 等. 吉林省梅花鹿副结核病, 结核病及布鲁菌病血清流行病学调查[J]. 中国兽医学报, 2013,33(11):1 696-1 699.

FU Zhi-jin, SONG Zhan-yun, FEN Xin, et al. (2013). Sero-epidemiological survey on prevalence of paratuberculosis sika deer in Jilin province [J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 33(11):1,696-1,699. (In Chinese)

[15]Collins, M. T. (1996). Diagnosis of paratuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice, 12(2):357-371.

Fund project:Support by national special project for fluffy sheep Industry (CARS-40-11), and science and technology planning project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (AQSIQ) (2015IK286).

Etiological Detection and Analysis of Paratuberculosis in Sheep

WU Jian-yong1, WU Xing-xing2, YANG Xue-yun1, LI Jian-jun1, WANG Deng-feng1,JIN Ying-hong1, WANG Guang-lei1, WANG Zhi-cai1

(1. Veterinary Research Institute, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830011, China;2.UrumqiCityAnimalDiseaseControlandDiagnosisCenter,Urumqi830063,China)

【Objective】 To determine the pathogenic characteristics of a sheep with suspected infection byMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.【Method】The specimen (sheep mesenteric lymph node) sent for testing was examined by microscopy after smearing and acid-fast staining. The mesenteric lymph node tissue genomic DNA was extracted, and theIS900 gene and subtype gene ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosiswere detected from tissue genomic DNA by PCR, then PCR products were sequenced and analyzed.【Result】Some acid-fast staining positive strains were found on smear, and the molecular detection and sequencing results ofIS900 gene and subtype gene showed that the target strain was identified as type Ⅱ (cattle type)Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.【Conclusion】It is confirmed that the sheep mesenteric lymph node tissue was the specimen infected with type Ⅱ (cattle type)Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisby microscopic examination and molecular detection.

Mycobacteriumaviumsubspparatuberculosis; sheep; etiological detection; sequence analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.027

2016-03-22

国家绒毛用羊产业技术体系专项(CARS-40-11)；国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2015IK286)

吴建勇(1984-)，男，湖南醴陵人，助理研究员，硕士，研究方向为动物微生物与免疫学，(E-mail)w19850505y@163.com

王治才(1955-)，男，甘肃高台人，研究员，研究方向为动物微生物与免疫学，(E-mail)zhicai.w@163.com

S855.1+2

A

1001-4330(2016)08-1562-07