日本血吸虫不同发育阶段虫体超微结构观察

邓玲玲，张向前，冯新港，贾英英，许静秀，史永红，李 浩，陆 珂，林矫矫,4，苑纯秀

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118； 3.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

·研究论文·

日本血吸虫不同发育阶段虫体超微结构观察

邓玲玲1，张向前2，冯新港1，贾英英2，许静秀3，史永红1，李 浩1，陆 珂1，林矫矫1,4，苑纯秀1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118； 3.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

为探寻不同发育阶段及不同性别间血吸虫生物学反应差异性的结构基础，本研究对不同发育阶段及雌、雄虫体间的超微结构进行了比较观察。经比较发现，血吸虫的体被和肠上皮两个直接跟外界接触的界面均在童虫阶段薄而致密，而成虫阶段这两个界面都更厚而稀疏。雌虫体被比同一发育阶段的雄虫体被致密，基膜比雄虫厚。了解血吸虫不同发育阶段及雌雄虫体间超微结构的差异性，有助于解释其生物学反应的差异性。

日本血吸虫；发育；超微结构

血吸虫是雌雄异体吸虫，在尾蚴钻入宿主皮肤后，要经历由童虫逐渐发育为成虫的过程。不同发育阶段的虫体或同一发育阶段的雌、雄虫体，对于体外培养的适应性[1,2]、药物的反应[3,4]、抗原性[5-7]等方面都存在差异。功能是以结构为基础的，不同发育阶段或不同性别虫体在结构上的差异性是不是造成生物学反应差异性的原因之一，带着这个问题，本文对不同发育阶段间及雌、雄虫体间超微结构进行了比较观察。

1 材料和方法

1.1 实验动物和日本血吸虫尾蚴 BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；日本血吸虫安徽株尾蚴由上海兽医研究所血吸虫病研究室的钉螺室提供。

1.2 不同发育阶段日本血吸虫日本血吸虫（安徽株）尾蚴感染BALB/c小鼠，40～1000条尾蚴/只小鼠，腹部贴片。分别在感染后d7、14、18、23、35、42剖杀，用含有抗凝剂的灭菌PBS溶液从肝门静脉灌注冲出虫体，PBS洗涤虫体3次，去除粘附的血细胞等其它杂质。在解剖镜下将14、18 d虫体雌雄分开，肉眼手工将23、35、42 d的虫体进行雌雄分开。将收集的虫体浸泡于2.5%的戊二醛（Sigma）溶液中进行前固定，4℃保存。

1.3 不同发育阶段日本血吸虫透射电镜样品 取出前固定样品，用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）冲洗3次，每次15 min。后固定：加入1%锇酸处理到样品变黑。再用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）冲洗3次，每次15 min。脱水：室温下，丙酮30%→50% →70%→80%→90%，每级作用30 min，纯丙酮再作用3次，每次作用30 min。渗透：无水丙酮/包埋剂＝5:1，作用12 h；无水丙酮/包埋剂＝3:1，作用12 h；无水丙酮/包埋剂＝1:1，作用12 h；无水丙酮/包埋剂＝1:3，作用12 h；无水丙酮/包埋剂＝1:5，作用12 h；纯包埋剂45℃作用12 h。包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12 h，60℃聚合36～48 h。超薄切片：在超薄切片机上进行超薄切片，因7 d虫体比较小，无法定位，随机切片外，其他阶段的雌雄虫体均分别选择腹吸盘下及虫体后端1/3处进行切片。正染色：超薄切片先醋酸铀染色30 min，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用柠檬酸铅染色10 min，双蒸水清洗3次，超薄切片干燥后，进行透射电镜观察。透射电镜型号为：FEI T12。

2 结果

2.1 不同发育阶段血吸虫体壁超微结构的比较

2.1.1 不同发育阶段虫体背部体壁的超微结构 图1示不同发育阶段血吸虫的背部体壁的超微结构。体壁由体被、基膜及体被下层构成[8]。随着虫体的生长发育，体壁的超微结构也随之变化。体壁最外层是体被（ 示体被），体被是细胞连体，由体被下层的体被细胞通过胞质小管将其内含物送到虫体表层形成。14 d（1B）、18 d（1D）、23 d（1F）至42 d （1H）雄虫间体被逐渐增厚，42 d雄虫的体被厚度约是18 d雄虫体被的2倍。体被的组成和结构也在变化，由体被下层运输到体被的分泌小体逐渐增多，如形态比较规则的环形体（ring body，Rb）。电镜下14 d雄虫的体被下层能见到少量的环形体，体被上少量分布。至18 d雄虫的体被下层环形体增多，并可见体被细胞（tegumental cell，Tc）分泌的环形体向体被运输（1D），体被上的环形体数量较14 d增多，至23 d及42 d雄虫体被上的环形体数量继续增多。另外还有一些形态不规则的颗粒状或者多膜囊分泌小体也逐渐增多，使得体被由致密逐渐变得疏松。不同发育阶段雌虫间的体被增厚幅度比相应阶段雄虫间小。体被下是基膜，由基质膜、基底膜和间质层构成，它完整地包裹着整个虫体。图2中所示的胶原纤维样结构即为基膜。相同发育阶段的雌虫基膜明显厚于雄虫，18 d（2A）、23 d（2C）至42 d（2E）雌虫基膜逐渐增厚，而相应阶段的雄虫基膜厚度差别不大。基膜下依次分布外环肌、内纵肌及体被细胞等，随着虫体的不断生长发育肌肉层逐渐增厚。同一发育阶段的雄虫一般较雌虫肌肉层厚；雌虫外环肌肌纤维束间连接比雄虫紧密，雄虫（2B、2D、2F）的外环肌肌纤维束间连接相对松散，在电镜下呈淡染。

图1 日本血吸虫背部体壁超微结构Fig.1 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

2.2.2 不同发育阶段虫体间腹面体壁的超微结构 图3示14 d（3A）、18 d（3B）、23 d（3C）及42 d （3D）雄虫的腹面抱雌沟处体壁。血吸虫的腹面体壁超微结构与背部超微结构有明显的区别。腹面抱雌沟内长有体棘，不同部位分布的体棘密度及大小不同，中段体棘密布，前、后段体棘较稀疏。腹面体被厚度比背部体被略薄，结构比背部体被紧密。腹面体被上多见大小和形状不规则的颗粒状或囊泡样的分泌小体，而在背部体被上较多分布的环形体在腹面较少见到。被腹面体被下的外环肌纤维束也存在差异，腹面的明显比被部的细小。

图2 日本血吸虫背部体壁超微结构Fig.2 Ultrastructure of dorsum body wall of Schistosoma japonicum

图3 不同发育阶段日本血吸虫腹面体壁超微结构Fig.3 Ultrastructure of ventral body wall of Schistosoma japonicum from different developmental stage

2.3 不同发育阶段虫体肠壁超微结构 血吸虫通过口腔不断吞噬宿主红细胞，红细胞在肠道中被蛋白分解酶所消化。图4显示不同发育阶段的虫体肠壁的超微结构，虫体肠上皮看似由网状纤维分支互相交织连接而成，网孔中可见线粒体等细胞器，网状纤维向肠腔内突出纤维细丝，网状纤维接近虫体实质的一侧分散镶嵌着肠上皮细胞，肠上皮外由肌层环绕。随着虫体的发育，肠上皮逐渐增厚，但密度减小，网状纤维的结构逐渐松散，突出入肠腔的纤维丝逐渐加长加密，纤维丝间隙中充满消化后的颗粒。由图5显示的结构推测，肠上皮是通过两条临近的突出网状纤维丝包绕消化物，末端彼此连接成闭合环状，将消化物以内吞的形式进行吸收，网状纤维组织内可见大小不等的含颗粒的内吞小泡。

图4 不同发育阶段日本血吸虫肠上皮超微结构Fig.4 Ultrastructure of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum from different developmental stages

3 讨论

图5 日本血吸虫肠上皮超微结构Fig.5 Ultrastracture of intestinal epithelium of Schistosoma japonicum

血吸虫为雌雄异体，整个虫体呈合抱状。体被和基膜完整包裹虫体，体被下层的体被细胞通过胞质小管向体被进行物质传递。虫体侵入终末宿主体内后，不断由宿主血液摄取营养物质，经过消化吸收转变成自身的组成成分。随着虫体的发育，体被的超微结构也随之变化，体被逐渐增厚但结构越来越疏松，体被上的分泌小体逐渐增多，这些逐步增加的成分是以宿主物质为原料产生的，因此体被结构里逐渐增加了来源于宿主的成分，这或许是血吸虫免疫逃避或者抗原伪装的物质基础。童虫阶段的体被比成虫阶段的明显致密，在制备透射电镜样品时，固定液不易穿透，因此童虫的内部结构没有成虫看起来清晰。吡喹酮对血吸虫成虫具有很强的杀灭效果，对早期钻入皮肤的童虫效果差或无效。童虫阶段和成虫阶段体被结构的差异性可能是造成这个结果的原因之一，童虫阶段体被致密，吡喹酮难以透过，无法进入虫体内部，达不到损伤虫体的效果。而成虫阶段体被疏松，吡喹酮易于渗透进入虫体内部，进而杀伤虫体。体外培养中童虫比成虫更容易存活，也可能是由于致密的体被帮助童虫更好的屏障外界，维持自身的渗透压和内环境的稳定。基膜位于体被之下，同一发育阶段的雌虫基膜明显比雄虫厚，而雌性虫体在体外培养中比雄虫更易存活，可能是因为雌虫的体被更紧密且基膜更厚，更好的屏障外界，减少自身的抗原物质与外界接触。

血吸虫体被下的肌肉层在背、腹面呈不对称分布，背部的肌层特别是外环肌比腹面的明显粗大，这个结构决定虫体主要靠背部肌群的收缩和舒张完成前后的匍匐运动。血吸虫的肌肉中可能包含不随意肌。新鲜收集的虫体剪断后进行培养，在长达2周的时间里，虫体的每一个片段都可以进行节律性的颤动，这种颤动可能来自于不受自主神经控制的肌群。这样看来虫体寄生在宿主体内，在不进行前后移位时，身体仍会不自主进行节律性的收缩舒张运动，帮助虫体消化或者物质的交换运输。

血吸虫主要靠在宿主体内摄食红细胞维持自身的物质和能量供应。肠壁的超微结构比较显示，伴随着虫体的发育肠上皮逐渐增厚，但是结构逐渐变得疏松。肠管是血吸虫直接与宿主接触的界面，在对宿主进行药物治疗时，是与药物直接接触的界面。吡喹酮对童虫的杀伤效果差，除了其体被的致密高，其肠壁的致密度高，药物难以渗透也是需要考虑的原因。

本研究对血吸虫不同发育阶段虫体的超微结构进行了比较观察，有助于从结构上理解不同发育阶段以及雌雄虫间在运动、体外培养、抗原性以及对药物的反应性等方面存在的差异性。

[1] 林建银, 李瑛, 周述龙.日本血吸虫肺期童虫体外培养的初步研究[J].寄生虫学与寄生虫病杂志, 1983, 1(3): 164-166.

[2] 周述龙, 华先欣, 李瑛, 等.长期体外培养日本血吸虫的体被及消化道的透射电镜观察[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1992, 10(1): 5-7.

[3] 肖树华, Catto B A, Webster L T, 等.不同发育期的曼氏血吸虫对吡喹酮敏感性差异的体内、体外试验观察[J].寄生虫学与寄生虫病杂志, 1983, (4): 17-18.

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ULTRASTRUCTURAL COMPARISON OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AT DIFFERENT DEVELOPMENTAL STAGES AND GENDERS

DENG Ling-ling1, ZHANG Xiang-qian2, FENG Xin-gang1, JIA Ying-ying2, XU Jing-xiu3, SHI Yong-hong1, LI Hao1, LU Ke1, LIN Jiao-jiao1,4, YUAN Chun-xiu1(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

To explore the structural basis that might cause diverse responses to biological treatments, the ultrastructures of worms at different developmental stages and genders of Schistosoma japonicum were compared in the present study.The teguments and intestinal epitheliums, through which worms contacted with the outside world directly, were thinner and more compact in schistosomulums than in adults.The teguments of female worms were more compact than in male worms at the same stage while the basal lamina of female worms were thicker than male worms at the same stage.The differences on ultrastructures may help explain different biological responses at different developmental stages or different genders of Schistosoma japonicum.

Schistosoma japonicum; development stages; ultrastructure

S852.735

A

1674-6422（2016）02-0042-05

2015-12-15

公益性行业（农业）科研专项（201303037）；国家自然基金项目（31172315）

邓玲玲，女，硕士研究生，预防兽医学专业

苑纯秀，E-mail：yuanchx@shvri.ac.cn