浓香型白酒窖泥钙化成因及缓解措施的初步探究

陈彬，闫寅卓*，王德良，陈翔

（1.中国食品发酵工业研究院，北京100015；2.江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

浓香型白酒窖泥钙化成因及缓解措施的初步探究

陈彬1，闫寅卓1*，王德良1，陈翔2

（1.中国食品发酵工业研究院，北京100015；2.江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

窖泥对于浓香型白酒的品质起着重要的作用，而目前各大酒厂窖池中的窖泥却频频出现钙化问题，直接影响了白酒的酒质。该研究通过对钙化窖泥和优质老窖泥在理化指标方面进行对比，得出窖泥钙化的主要原因是：由于窖泥中水分降低、pH降低等因素，导致窖泥中形成乳酸钙、乳酸铁等白色晶体，使得窖泥板结、出现白斑，质量下降。鉴于此，该研究采取在窖泥中加入产碱杆菌（Alcaligenessp.）、酒花酸浸提液和乳酸链球菌肽（Nisin）3种措施，以此来缓解窖泥的钙化问题。结果表明，发现3种措施均能够缓解窖泥的钙化，且3种措施缓解的侧重点不同，综合分析后发现加入Nisin的效果最佳。

窖泥；钙化；原因；缓解措施

众所周知，生产浓香型酒，窖泥是基础，大曲是动力，工艺是关键[1]。好酒源自好窖，便是这个道理[2]。优质的窖泥被称为“泥巴国宝”、“黄金微生物”等，其一直吸引着众多学者的高度关注[3]。窖泥中栖息着大量的微生物，这些微生物错综复杂，其中对于浓香型白酒产生重要影响的己酸菌、乳酸菌、乙酸菌、甲烷菌等，特别是己酸菌[5-6]。因此窖泥质量的好坏，直接影响着其内部的菌系结构，并对酒质造成较大影响[7]。

由于种种因素，窖泥在使用几年后会出现不同程度的退化现象，窖泥逐渐盐碱化、僵硬，窖壁表面及窖底析出浅白色颗粒或针状结晶物质，即窖泥的“钙化”现象[8-9]。这严重影响了窖泥中的微生物菌系，特别是己酸菌的生长。目前国内主要通过变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术对窖泥中的微生物组成、结构，进行分析研究[10-12]，而国外几乎没有对其研究。而对于钙化的定义以及钙化窖泥对酒质的影响，还未见详尽的报道与总结；因此分析钙化窖泥中的成分以及如何解决钙化现象，将是研究窖泥的主体方向。

本实验通过对钙化窖泥和优质窖泥的理化成分进行分析研究，并进行了窖泥钙化缓解措施的初步探究，该研究系统揭示了窖泥钙化形成因素，为行业中缓解窖泥钙化提供了技术和理论上的支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

窖泥：江苏洋河酒厂股份有限公司（洋河酒厂、双沟酒厂）；产碱菌（Alcaligenessp.）：中国工业微生物菌种保藏中心；乳酸、乙酸、甲酸、丙酮酸、戊酸、己酸（均为色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

酒花酸浸提液：巴特哈斯（北京）贸易有限公司；Nisin：天津艾玛斯特生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

Multiwave 3000安东帕微波消解仪：奥地利安东帕（中国）有限公司；DNP-9162电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；NexION 350电感耦合等离子体质谱仪：珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；ISC3000离子色谱仪：美国DIONEX公司；Autosystem XV气相色谱仪：美国PerkinElmer公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份公司。

1.3实验方法

1.3.1窖泥水分、pH和氧化还原电位的测定

取窖泥10 g（精确至0.001 g），在105℃烘箱内烘3 h，取出后，迅速移入干燥器内冷却0.5 h，称量。再放入电热干燥箱内，继续烘干1 h，冷却称量，直至恒质量，以此来计算窖泥水分含量；取窖泥10 g，溶解在100 mL超纯水中，过滤后，用pH计测定其pH值和氧化还原电位。

1.3.2窖泥中金属离子的测定[10]

为了测定窖泥中的金属离子，该实验采用NexION 350电感耦合等离子体质谱仪，具体操作如下：取少量窖泥，风干7 d后进行研磨，并过200目筛子。称量0.2 g（精确至0.001 g），放置到消解罐中，在消解罐中加入4 mL硝酸（HNO3），2 mL H2O2，2 mL氢氟酸（HF）后置于微波消解仪中消解1 h。消解结束后，加入1 mL高氯酸（HClO4），放置到加热板上，蒸发至剩余1 mL左右。消解罐中的样本转入50 mL的定容瓶中，用1%的HNO3进行定容，再用1%的HNO3将其稀释100倍进行上机测试[13-14]。

1.3.3窖泥中有机酸的测定

采用ISC3000离子色谱仪对窖泥中有机酸进行测定。取窖泥5g，溶解于25mL的超纯水中，充分振荡后，1 800 r/min离心10 min；采用0.45 μm的水相膜进行过滤，稀释100倍后上机测样。仪器设置条件如下：柱子型号为IONPAAG11-HC（4 mm×50 mm），柱温30℃，氮压6 kPa。为了保证样品数据的真实性，需每隔5个样本加入一个标准样（质量浓度为50 μg/L的乳酸）进行校正。

1.3.4窖泥钙化的缓解措施

表1　实验中窖泥3种添加方式的添加量Table 1　Additive amounts of pit muds by three measures in the experiments

由于双沟酒厂窖泥钙化现象较为严重，在对其窖泥进行了理化性质探究的基础上，主要采取了以下3种措施：①加入产碱菌（Alcaligenessp.）液；②加入酒花酸浸提液；③加入Nisin；制备方式，添加量及所用窖泥、酒醅量详情见表1。将3种制备液与窖泥混合均匀，然后涂抹到小型瓷罐壁上，加入酒醅后密封。经过40 d的发酵，并结合窖泥和酒醅理化指标，以此来判断这些措施是否有效。

1.3.5酒醅中风味物质的测定

取发酵完成后的酒醅25 g，加入50 mL体积分数为70%的乙醇，蒸馏出25 mL，然后过0.45 μm的有机膜，进行气相色谱检测。气相色谱条件：CP-Wax 57 CB毛细管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），载气（高纯氮）：流速1 mL/min，分流比：10∶1；氢气：流速为45 mL/min；空气：流速为450 mL/min；检测器温度270℃；进样器温度240℃；进样量1 μL。为了保证测得结果的准确性，加入3个混合内标，其分别为异戊醛、异戊醇、己酸异戊酯。

2　结果与分析

2.1窖泥钙化的成因

为了找到窖泥钙化的形成原因，将钙化窖泥和优质窖泥的理化性质（水分含量、pH值、氧化还原电位、金属离子和有机酸含量）进行对比。

2.1.1窖泥含水量、pH值和氧化还原电位

根据前人研究发现，钙化窖泥相对于优质窖泥，其主要表现为窖泥僵硬，甚至出现白色晶体，且其主要发生在窖泥使用周期的中后期。因此窖泥质量的优劣，最直观的表现即为含水量和pH值。钙化窖泥和优质窖泥在含水量、pH值和氧化还原电位方面的对比结果见表2。

表2　窖泥的含水量、pH值和氧化还原电位Table 2　Moisture content,pH and redox potential of the pit mud

由表2可知，钙化窖泥无论是窖底还是窖壁，其含水量均较低；pH值也较低，而氧化还原电位较高。同时发现窖池的窖壁含水量高于窖底；而窖底的pH略高，氧化还原电位较低，提高窖泥的pH值可能是缓解窖泥发生钙化的一个途径。因此结合生态酿酒的理念，提出采用添加产碱杆菌，从微生物的角度改善窖泥的钙化现象。

2.1.2窖泥中金属离子

由于钙化窖泥的主要成分是乳酸钙及乳酸铁结晶[15]，因此钙、铁等金属离子是导致钙化的主要原因，也是需要重点考察的因素之一。本实验采集洋河和双沟两个基地的钙化窖泥及未钙化的窖泥进行对比分析，结果如图1所示。

图1　不同窖泥中主要金属离子含量的对比Fig.1　Comparison of main metal ions contents in different pit mud

由图1可知，钙化窖泥比无钙化窖泥中的Ca、Mg、Fe等金属离子含量高，且双沟基地的窖泥含量均高于洋河基地。计算得到洋河基地中的钙化窖泥中的钙离子约为无钙化窖泥的17倍、镁离子约12倍、铁离子约5倍；而双沟基地的钙化窖泥中的钙离子约为无钙化窖泥的26倍、镁离子约23倍、铁离子约101倍。结果表明，洋河基地中的钙化窖泥主要是钙离子，而双沟基地的钙化窖泥中，铁离子的含量远远高于其他窖泥，且高于钙离子的含量。

2.1.3钙化和无钙化窖泥中有机酸的对比分析

由于窖泥普遍为酸性，且形成的钙化结晶主要为有机酸盐类[8]，因此需要对窖泥中的有机酸进行分析检测，结果如图2所示。

图2　不同窖泥中的有机酸离子含量的对比Fig.2　Comparison of organic acid ions contents in different pit mud

由图2可知，在各样品中的乳酸含量较高，而钙化样品的乳酸含量更占有绝对优势，同时存在一定量的乙酸。洋河基地的钙化窖泥中的乳酸约为无钙化窖泥的8倍；双沟基地的为12倍。钙化窖泥中乳酸大量增加，其含量远远超过了正常酿造体系中的乳酸含量，从而导致了钙化现象的发生。因此若想缓解或解决钙化的问题，需要一定程度上抑制有机酸产生菌，通过大量前期研究工作，本实验选取1%的酒花酸浸提液和5‰的Nisin进行抑制有机酸产生菌的生长。

2.2三种措施缓解窖泥钙化的结果

由于双沟窖泥钙化较为严重，因此特地选取双沟窖泥进行实验。通过对比实验组和对照组窖泥在水分含量、pH值、氧化还原电位、金属离子、有机酸和酒醅的风味物质方面的差异，以此来判断措施的可行性。

2.2.1三种缓解措施在水分含量、pH值和氧化还原电位的对比

对发酵40 d后的窖泥进行了基本的指标测定，具体结果见表3。

表3　窖泥的基本理化指标Table 3　Basic physical and chemical indexes of pit mud

由表3可知，在发酵40 d后，经过三种措施处理后，发现其能显著缓解窖泥的pH值降低，氧化还原电位升高的问题。而含水量则基本不变，推测可能由于实验密封性较好，水分基本没有挥发。而通过横向对比，发现加入酒花酸浸提液和Nisin的窖泥在pH和氧化还原电位效果较好，尤其是酒花酸浸提液。

2.2.2金属离子含量的结果对比

通过对比分析窖泥中金属离子含量，特别是钙离子和铁离子，可以大体的了解窖泥的钙化状况。ICP-MS法测量得到的窖泥中金属离子含量结果见表4。

表4　窖泥中部分金属离子的含量Table 4　Contents of partial metal ions in pit mudmg/g

由表4可知，在发酵过程中，Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe3+和Zn2+，都有显著的提高，特别是Ca2+和Zn2+，分别提高了大约10倍和40倍；而通过前面钙化窖泥和非钙化窖泥的对比分析，了解影响窖泥钙化的主要金属离子是Ca2+、Fe2+和Mg2+，因此主要对这三种离子进行了分析，结果见图3。

图3　窖泥中3种金属离子含量对比图Fig.3　Comparison of 3 metal ions contents in pit mud

由图3可知，窖泥中加入产碱菌、酒花酸和Nisin，都能够有效降低窖泥中Ca2+、Fe3+和Mg2+，特别是加入产碱菌后；与对照组相比，其Ca2+降低了26.1%，Fe3+降低了15.1%，Mg2+降低了12.8%。通过采取的三种措施，能够解决窖泥钙化过程中金属离子含量增多的问题，从而缓解了窖泥的钙化；其中，效果最明显的是加入产碱菌，这可能是由于升高了窖池的pH，减少了Ca2+、Fe3+等金属离子形成乳酸钙、乳酸铁等沉淀的量。

2.2.3有机酸含量的结果对比

前期工作发现钙化窖泥中乳酸根离子含量极高，因此在采取三种缓解措施后，本实验针对有机酸根离子，特别是乳酸根离子进行了检测，结果见表5。

表5　窖泥中各种有机酸的含量对比Table 5　Comparison of various organic acids contents in pit mud mg/g

由表5可知，在初始窖泥中，各种有机酸都是比较均匀，但是在经过发酵后，可以看出己酸、乙酸和丙酮酸都有所下降，特别是己酸，而乳酸则含量大增。虽然发酵后的乳酸大量增加，但经过三种措施处理后，其乳酸含量有着明显的降低。在窖泥中加入产碱菌、酒花酸浸提液和Nisin处理后，分别下降了63.2%、62.0%、96.1%。结果表明Nisin的效果最佳。推测产生这种现象的原因是窖泥中的乳酸钙、乳酸铁等沉淀量下降，进而使乳酸含量降低，缓解窖泥的钙化。

2.2.4酒醅中的风味物质对比

虽然采用三种措施可以一定程度上缓解窖泥的钙化，但由于外源添加非酿酒物质，需要针对这些措施是否会影响最终的酒质进行评估。经过40 d的发酵，酒醅经过蒸馏，气相色谱分析，酒醅中风味物质检测结果见表6。

表6　酒醅中各种风味物质的对比Table 6　Comparison of various flavor substances in fermented grains mg/100 mL

由表6可知，经过三种措施的实施后，酒醅中的风味物质有所改变，酒醅中的己酸乙酯均有了显著提高，乙酸乙酯也有所提高，乳酸乙酯有所下降。由于己酸乙酯是浓香型白酒中的主体呈香呈味物质，己酸乙酯含量增加有助于提高浓香型白酒的特有香气、口感，并且经过专家鉴定酒质更加醇厚、酯香更加突出。因此采取加入Nisin这种措施，对酒质提升也是非常好的帮助。

3　结论

通过分析钙化窖泥和非钙化窖泥的理化性质，总结窖泥钙化产生的原因主要有以下几点：含水量的降低、pH的降低、氧化还原电位的升高、金属离子的升高（主要是Ca2+、Fe3+和Mg2+）、乳酸含量的升高。这几个原因之间是相互联系的，例如，由于钙化窖泥中含有较多的Ca2+和乳酸跟离子，其在pH较低、水分含量降低的环境下，会结晶形成白色的乳酸钙。因此，要解决窖泥的钙化问题，必须综合治理；不能单独根据单一指标来判断某一项措施对窖泥钙化问题缓解的成效。

经过采取加入产碱菌、酒花酸浸提液和Nisin措施后，研究发现这几种措施对于缓解窖泥钙化均有所帮助，不同的措施侧重点不同，例如，酒花酸浸提液对于缓解窖泥含水量降低、pH降低、氧化还原电位升高方面有着较好的效果；产碱菌对于降低金属离子，特别是Ca2+方面有着显著效果；Nisin对于缓解窖泥含水量降低、pH降低、氧化还原电位升高等方面均有显著的效果。

总体来说，窖泥中添加Nisin的效果更佳，其不仅可以改善窖泥钙化的问题，还可以提高浓香型白酒的品质。

[1]倪斌，任道群，唐玉明，等.浓香型酒人工窖泥酿造过程中微生物变化研究[J].中国酿造，2012，31（6）：157-160.

[2]姚万春，唐玉明，任道群，等.功能性人工窖泥培养配方筛选研究[J].中国酿造，2014，33（8）：71-74.

[3]DENG B,SHEN C H,SHAN X H,et al.PCR-DGGE analysis on microbial communities in pit mud of cellars used for different periods of time [J].J I Brewing,2012,118(1):120-126.

[4]王明跃，张文学，王海英，等.不同窖龄窖泥细菌的系统发育多样性分析[J].食品科学，2013，34（11）：177-181.

[5]LUO Q,LIU C,WU Z,et al.Monitoring of the prokaryotic diversity in pit mud from a Luzhou-flavour,liquor distillery and evaluation of two predominant archaea using qPCR assays[J].J I Brewing,2014,120(3): 253-261.

[6]任道群，唐玉明，姚万春，等.多菌株共酵培养优质窖泥的研究[J].中国酿造，2013，32（6）：61-64.

[7]武玉涛.浅析人工窖泥退化原因及其预防[J].邯郸职业技术学院学报，2010，23（1）：55-60.

[8]周恒刚.窖泥培养[M].北京：中国计量出版社，1998：124-130.

[9]任道群，刘茂柯，唐玉明，等.浓香型酒窖泥理化特性的研究[J].中国酿造，2014，33（10）：55-57.

[10]DENG B,SHEN C H,SHAN X H,et al.PCR-DGGE analysis on microbial communities in pit mud of cellars used for different periods of time [J].J I Brewing,2012,118(1):120-126.

[11]杜礼泉，罗惠波，黄治国，等.不同质量的窖泥细菌群落的研究[J].中国酿造，2014，33（10）：113-117.

[12]潘玲玲，王媚，罗明有，等.浓香型白酒黄水、窖泥中微生物总DNA提取方法比较[J].中国酿造，2016，35（4）：47-51.

[13]张莹，夏于林，杨宜，等.应用ICP-MS在线内标法测定白酒中五种重金属元素方法的研究[J].中国酿造，2011，30（4）：169-171.

[14]张莹，夏于林，刘彬，等.多粮浓香型白酒酿酒专用粮多种金属元素检测方法的建立和研究[J].中国酿造，2012，31（10）：172-175.

[15]张家庆，宋瑞滨，曹敬华，等.人工老窖窖泥结晶初步分析[J].中国酿造，2014，33（3）：21-23.

Preliminary research on the calcification causes and mitigation measures of Luzhou-flavourBaijiupit mud

CHEN Bin1,YAN Yinzhuo1*,WANG Deliang1,CHEN Xiang2
(1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 2.Jiangsu Yanghe Distillery Co.,Ltd.,Suqian 223800,China)

Pit mud plays an important role in the quality of Luzhou-flavourBaijiu.However,at present,most manufactories find that the calcification of pit mud appears frequently,which directly influence the quality ofBaijiu.The physicochemical indexes of calcified pit mud and quality aged pit mud were compared.It was concluded that the main reasons of the pit mud calcification were low moisture content,low pH and other related factors, which might result in the formation of white crystal(calcium lactate and lactic acid,iron,etc)in pit mud to make it compacted,white patches appeared,and quality degraded.In order to alleviate the calcification of pit mud,three measures were carried out by addingAlcaligenessp.,hop α-acid extract liquid and Nisin in pit mud.The results showed that the all three measures could alleviate the calcification of pit mud,and adding Nisin had the optimal effects by comprehensive analysis.

pit mud;calcification;reason;mitigation measures

TS261.4

0254-5071（2016）10-0036-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.009

2016-07-19

国家自然科学基金资助项目（31401680）

陈彬（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品发酵。

闫寅卓（1986-），女，高级工程师，博士，研究方向为食品发酵。