糖尿病早期大鼠视网膜功能损伤及白藜芦醇防护作用研究*

曾凯宏，王 元，邓 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黄璐娇

1.四川省医学科学院·四川省人民医院 临床营养科 (成都 610072)；2.电子科技大学 医学院(成都 610054)



·论 著·

糖尿病早期大鼠视网膜功能损伤及白藜芦醇防护作用研究*

曾凯宏1,2，王 元2，邓 波1，余雪梅1，宋 怡1，周 雪1，黄璐娇1

1.四川省医学科学院·四川省人民医院 临床营养科 (成都 610072)；2.电子科技大学 医学院(成都 610054)

目的 探讨糖尿病早期大鼠视网膜功能的损伤及白藜芦醇的防护作用。方法 采用链脲佐菌素一次性腹腔注射SD大鼠建立大鼠糖尿病模型，随机分为正常对照组和糖尿病组，低剂量(5 mg/kg/d)和高剂量(10 mg/kg/d)白藜芦醇干预正常对照组和糖尿病组，分别在实验1、3、5、7月测定视网膜电图。结果 糖尿病早期视网膜scotopic 0.01 ERG b波振幅、scotopic 3.0 ERG a波和b波振幅、scotopic 3.0 OPS OP2潜时和振幅发生改变，低剂量和高剂量白藜芦醇干预对上述视网膜功能损伤有明显抑制效应(P<0.05)。结论 白藜芦醇对糖尿病早期大鼠视网膜功能损伤有防护作用。

视网膜功能损伤；白藜芦醇；糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的常见并发症，是导致成人失明的主要原因。DR早期视网膜的改变主要包括：视网膜电图(electroretinogram, ERG) a波和b波的改变[1-2]、神经细胞凋亡、胶质细胞反应性增生和VEGF 的分泌增加等[3-6]。ERG是视网膜受到光刺激后从角膜纪录到的一组视网膜电位变化，ERG的a波主要反映视网膜光感受器的变化，ERG的b波可能是来源于视网膜Müller细胞和双极细胞的跨膜电流，主要反映视网膜内核层的电活动。ERG的检查对DR的早期改变是敏感的[7]。

白藜芦醇(resveratrol, RSV)是一种具有延长寿命、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血栓、保护心脏和保护血管等作用的多酚类植物抗菌素[8-10]，主要通过有效减少脂质过氧化物和促炎症细胞因子在体内的含量，降低空腹血糖水平及细胞凋亡水平，增强机体抗氧化能力发挥其抗糖尿病作用[11]。近年来，RSV已被国内外学者广泛应用于糖尿病及其并发症的研究中，但其对DR视网膜早期功能损伤的干预作用，至今仍鲜有报道。

本文采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导建立大鼠糖尿病模型，通过测定ERG研究RSV对糖尿病大鼠早期视网膜功能损伤的防护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级成年Sprague-Dawley(SD)大鼠购于四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所。

1.2 试剂及仪器

RSV纯品和STZ购于美国Sigma公司，视网膜电图仪由四川省医学科学院·四川省人民医院“人类疾病基因研究四川省重点实验室”提供。

1.3 糖尿病大鼠模型建立及实验分组

实验前大鼠禁食12 h，可自由饮水，以STZ诱导建立糖尿病大鼠动物模型，实验前用0.1 mol/L(pH 4.2)的柠檬酸缓冲液配制成2 % STZ溶液，按60 mg/kg一次性左下腹腔注射STZ，于72 h后检测定性尿糖和血糖，用尿糖试纸检测尿糖达(+++)以上，尾静脉采血测血糖浓度大于16.7 mmol/L即为模型建立成功。

实验共分6组，分别为：正常对照组(CON)、糖尿病组(DM)，低剂量(5 mg/kg/d)和高剂量(10 mg/kg/d)RSV干预正常对照组(CON+L-RSV; CON+H-RSV)和糖尿病组(DM+L-RSV; DM + H-RSV)。

1.4 ERG检测

分别在实验1、3、5、7月对各组大鼠进行ERG测定。大鼠暗适应3 h以上，然后腹腔注射速眠新注射液进行麻醉。将麻醉状态的大鼠固定于实验台上，左眼滴托品酰胺散瞳，尾部、左侧颊部和左眼角膜表面分别安放接地电极、参考电极和记录电极，并在角膜表面滴甲基纤维。参考电极和接地电极由不锈钢针制成，记录电极为0.2 mm银-氯化银制成的环形电极。采用视网膜电图仪进行scotopic 0.01 ERG、scotopic 3.0 ERG、scotopic 3.0 OPS、Photopic 3.0 ERG和Photopic 3.0 Flicker Response测定。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 RSV对糖尿病大鼠一般情况、体质量及血糖的影响

CON组、CON+L-RSV组及CON+H-RSV组大鼠每日饮水量、尿量正常，精神佳，对刺激敏感。与CON组大鼠相比，DM组大鼠出现明显多饮、多尿、多食及消瘦，大便稀，毛无光泽污秽，精神差，生长慢，对刺激不敏感。与DM组大鼠相比，DM+L-RSV和DM+H-RSV大鼠上述表现明显减轻， DM+H-RSV组比DM+L-RSV组作用更明显。

整个实验期间，CON组、CON+L-RSV组及CON+H-RSV组大鼠体质量明显增加，与CON组大鼠相比，DM组大鼠体质量在整个实验期间增加不明显， DM+L-RSV组和高剂量DM+H-RSV组大鼠体质量增加虽然比DM组明显(P<0.05)，但与正常组相比，体重增加明显低于CON组、CON+L-RSV组及CON+H-RSV组大鼠(P<0.05)(表1)。

整个实验期间，CON组大鼠血糖始终维持在正常水平； DM组大鼠血糖明显高于CON组， DM+L-RSV组和DM+H-RSV组大鼠血糖明显低于DM组，但仍明显高于CON组(P<0.05)(表1)。

2.2 RSV对糖尿病大鼠视网膜功能损伤的防护作用

2.2.1 对Scotopic 0.01 ERG改变的防护作用 与CON组相比，DM组a波潜时、a波振幅、b波潜时在整个实验期间无明显改变。然而，DM组b波振幅在整个实验期间明显低于CON组，DM+L-RSV组和DM+H-RSV组b波振幅明显增加，呈剂量效应关系(P<0.05)。CON+L-RSV组和CON+H-RSV组b波振幅与正常组比较无明显差异(图1)。

表1 RSV对糖尿病大鼠体质量和血糖的影响

注：与CON组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05

图1 RSV对糖尿病大鼠视网膜Scotopic 0.01 ERG改变的影响

注：与CON组比较，***P<0.001；与DM组比较，#P<0.05；与DM组比较，###P<0.001

2.2.2 对Scotopic 3.0 ERG改变的防护作用 如图2所示，a波、b波潜时在各组之间无明显差异，DM组a波、b波振幅明显低于CON组，DM+L-RSV组和DM+H-RSV组a波、b波振幅明显增加，呈剂量效应关系(P<0.05)。CON+L-RSV组和CON+H-RSV组a波、b波振幅与正常组比较无明显差异。

2.2.3 对Scotopic 3.0 OPS改变的防护效果 如图3所示，与CON组相比， DM组OPS OP2潜时在各个时间点均明显延长，DM+L-RSV组和DM+H-RSV组OPS OP2潜时明显缩短，呈剂量效应关系(P<0.05)。CON+L-RSV组和CON+H-RSV组OPS OP2潜时与正常组比较无明显差异。如图4所示，DM组OPS OP2振幅明显低于CON组，低剂量和高剂量RSV干预可明显增加DM组OPS OP2振幅，呈剂量效应关系(P<0.05)。CON+L-RSV组和CON+H-RSV组OPS OP2振幅与正常组比较无明显差异。

图2 RSV对糖尿病大鼠视网膜Scotopic 3.0 ERG改变的影响

注：与CON组比较，***P<0.001；与DM组比较，#P<0.05；与DM组比较，###P<0.001

图3 RSV对糖尿病大鼠视网膜Scotopic 3.0 OPS改变的影响

注：与CON组比较，***P<0.001；与DM组比较，###P<0.001

3 讨论

糖尿病发展成DR是一个缓慢的过程，一般需要5～6年。糖尿病从明确诊断到眼底出现改变的阶段被称作DR的临床前期。研究发现，DR的临床前期是先有视网膜组织代谢损害，然后才出现组织学改变或眼底镜下可见的血管异常改变。研究认为，视网膜神经胶质和神经元功能异常出现最早，ERG检测对于DR的临床前期视网膜神经功能的改变非常敏感[7]。ERG是从视网膜的细胞水平评价视觉功能。大量研究发现，患糖尿病两星期的大鼠，ERG的振幅比正常对照组低，对b波的影响较a波大。在1个月的糖尿病大鼠闪光ERG中，a波与b波的振幅均减少[7]。本研究发现，糖尿病早期视网膜scotopic 0.01 ERG b波振幅、scotopic 3.0 ERG a波和b波振幅、scotopic 3.0 OPS OP2潜时和振幅均发生不同程度的改变。

目前国内外关于DR防护的多数研究证明，高级糖基化终产物抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂及一些抗氧化剂等对DR有防护效应，但对DR早期视损伤防护效果不明显[12-13]。我们采用抗氧剂牛磺酸对DR早期RMCs损伤干预后发现，低浓度的牛磺酸干预对RMCs损伤基本没有防护效应，高浓度牛磺酸干预对RMCs损伤虽有一定防护效应，但牛磺酸干预后DR早期患者视功能改善情况并不理想[6]。可能存在以下两个原因：1)作用效力不够；2)作用时间滞后。因而寻找更有效、更早期的抗早期DR损伤的措施十分必要。本研究采用抗氧化能力强的RSV干预糖尿病大鼠发现，低剂量和高剂量RSV干预对糖尿病早期大鼠视网膜功能损伤有明显抑制效应，可能是今后防护DR早期功能损伤的有效手段。

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A Study on the Early Retinal Dysfunction of Diabetic Rats and the Protective Effect of Resveratrol

Zeng Kaihong1,2, Wang Yuan2, Deng Bo1, Yu Xuemei1, Song Yi1, Zhou Xue1, Huang Lujiao1.

1. Department of Clinical Nutrition, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072, China; 2. School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China

Objective To investigate the early retinal dysfunction of diabetic rats and the protective effect of resveratrol (RSV) on the retina of the diabetic rats. Methods The Sprague-Dawley rats were treated with a single intraperitoneal (i.p.) injection of streptozotocin (STZ) 60 mg/kg to establish the diabetic models. The rats were randomly divided into six groups as follows: normal control rats (CON); 5 mg/kg/day and 10 mg/kg/day RSV treated normal control rats (CON + L-RSV; CON + H-RSV); diabetic rats (DM); 5 mg/kg/day and 10 mg/kg/day RSV treated diabetic rats (DM + L-RSV; DM + H-RSV). The electroretinograms (ERGs) were used to measure the retinal functions of rats. Results The diabetes induced the changes in the amplitude of b-wave in scotopic 0.01 ERG and a- and b-wave in scotopic 3.0 ERG, and in the latency and amplitude of OP2 in oscillatory potentials. The resveratrol intervention of both low and high doses inhibited significantly the retinal dysfunction of diabetic rats (P<0.05). Conclusion Resveratrol has an inhibitory effect on the retinal dysfunction of diabetic rats.

Retinal dysfunction; Resveratrol; Diabetic retinopathy

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20150816.1125.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.001

国家自然科学基金项目(No:81202206)；四川省卫生计生委项目(No:150216)

R587.1；R774.1

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