EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌临床分期中的诊断价值*

管振祺，何凤屏△，邱世洁，张相国，马占忠，刘玉兰，郭艳乐，张河林，张 思

(1.汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东汕头 512026；2.广东医科大学，广东汕头 523770)



·论 著·

EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌临床分期中的诊断价值*

管振祺1，何凤屏1△，邱世洁2#，张相国1，马占忠1，刘玉兰1，郭艳乐1，张河林1，张 思1

(1.汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东汕头 512026；2.广东医科大学，广东汕头 523770)

目的 探讨EB病毒(EBV)DNA定量检测在鼻咽癌患者不同临床分期中的诊断价值。方法 选取广东省汕头大学医学院附属粤北人民医院2013年3月至2015年12月500例病理诊断为鼻咽癌的患者作为研究组，同时选取200例健康体检人群作为对照组。2组同时采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测血浆EBV-DNA的表达量，并对2组之间及临床TNM分期I、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ的结果进行比较；再将其分别与酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测的血清EBV病毒壳抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)检测结果进行比较。结果 荧光定量PCR方法检测EBV-DNA表达量中，研究组阳性率75.00%，对照组阳性率9.00%，两者差异有统计学意义(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数与临床TNM分期呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)；鼻咽癌分期越晚，血浆EBV-DNA拷贝数越高。结论 血浆EBV-DNA水平与鼻咽癌患者临床TNM分期有显著相关性，可作为评估鼻咽癌患者临床分期的1种辅助性分子生物指标，具有较高应用价值。

鼻咽癌； EB病毒； 荧光定量聚合酶链式反应

大量研究证实，EB病毒(EBV)与鼻咽癌关系密切[1]。目前，EBV采用于临床的检验指标包括病毒壳抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)、早期抗原免疫球蛋白A(EA-IgA)、EBV特异性DNA酶(EBV-DNase)抗体水平及血浆EBV-DNA定量测定[2-3]。其中血浆EBV-DNA定量测定是近年发展起来的EBV血清学标志物检测技术[3]，但EBV-DNA与鼻咽癌分期尚不清楚。本研究对广东省汕头大学医学院附属粤北人民医院(后简称粤北人民医院)200例初治、300例复诊的鼻咽癌患者血浆EBV-DNA定量测定结果进行分析，并探讨其在鼻咽癌临床分期的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年3月至2015年12月在粤北人民医院病理确诊为鼻咽癌患者500例作为研究组(初治200例、复诊300例)，年龄23～75岁；男307例，女193例。所有的患者按照TNM分期标准和世界卫生组织2002标准进行分型[4]，其中Ⅰ型8例(占总数1.6%)，Ⅱ型39例(占总数7.8%)，Ⅲ 型453例(占总数90.6%)。500例患者中T1期52例，T2期93例，T3期218例，T4期137例；N0期104例，N1期160例，N2期197例，N3期39例；M0期471例，M1期29例。同期选取本院健康体检人群200例作为对照组，年龄25～65岁。本研究得到医院伦理委员会批准和受检者的知情同意。

1.2 仪器与试剂 EBV-DNA检测试剂盒购自达安基因股份有限公司，采用TapMan荧光探针基因聚合酶链式反应(PCR)扩增法，检测方法参考试剂说明书。VCA-IgA检测试剂盒购自北京贝尔生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 分别用促凝管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取患者静脉血2 mL，全血经3 000 r/min离心，分离获得血清，-20 ℃保存备用。根据试剂盒说明书操作进行DNA提取。EBV-DNA定量测定均采用荧光定量PCR法[3]。DNA水平大于1×103copy/mL判断为阳性[4]，DNA水平小于或等于1×103copy/mL判断为阴性。

1.3.2 EBV-VCA-IgA检测(ELISA法) 采用ELISA方法检测血清中VCA-IgA，Cut-off值小于0.08为阴性，大于或等于0.08且小于或等于0.80为弱阳性(可疑)，大于0.80为阳性。具体步骤：取出试剂盒置室温平衡30 min，将20×洗涤液用蒸馏水做20倍稀释。取出包被板，做好标记，留1个孔作空白对照，将板条固定于板架上，剩余板条用不干胶密封并放入密封袋中保存。阴性对照孔3个，阳性对照孔1个，各加入100 μL对照血清。空白对照孔1个空置，其余每个孔加入100 μL样品稀释液，每个孔加入待测样品10 μL，将反应板轻轻震荡使样品混匀。用封板膜封板后，置37 ℃温箱中反应30 min。温育后，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30～60 s。每孔加入100 μL酶标工作液，空白孔除外。用封板膜封板后，置37 ℃温箱中反应30 min。用洗涤液洗板5次，每次浸泡30～60 min。每孔加入终止液50 μL，轻轻震荡混匀。酶标仪450 nm比色测量Cut-off值。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析处理。血浆EBV-DNA拷贝数及阳性率采用非参数检验方法(Kruskal-Wallis)和χ2检验。比较不同T分期、N分期、M分期的EBV-DNA拷贝数。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组检测结果 研究组荧光定量PCR方法的阳性率均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组ELISA方法的阳性率均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组荧光定量PCR方法的阳性率高于ELISA方法，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 IgA抗体和EBV-DNA在研究组和对照组阳性率比较(%)

2.2 EBV阳性率与鼻咽癌患者临床分期的关系 500例鼻咽癌患者血浆EBV-DNA定量测定EBV阳性率为78.5%(392/500)，其中强阳性72例(14.4%)，阳性230例(46.0%)，弱阳性90例(18.0%)。比较不同T分期的EBV-DNA拷贝数，差异有统计学意义(χ2=37.31，P=0.000)，见表2。比较不同N分期的EBV-DNA拷贝数，差异有统计学意义(χ2=61.77，P=0.000)，见表3。比较不同M分期的EBV-DNA拷贝数，差异有统计学意义(χ2=71.82，P=0.000)，见表4。

表2 T分期与EBV-DNA定量测定关系(copy/mL)

表3 N分期与EBV-DNA定量测定关系(copy/mL)

表4 M分期与EBV-DNA定量测定关系(copy/mL)

2.3 2种方法在不同临床分期检测结果的比较 在TNM分期中，EBV-DNA阳性率(92.80%)高于VCA-IgA(69.40%)，ELSIA方法检测Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者VCA-IgA阳性率分别为64.00%和82.60%，而PCR方法检测Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者EBV-DNA阳性率分别为93.10%和94.00%，2种方法比较差异有统计学意义(P<0.05)。此外，2种方法Ⅲ期、Ⅳ期结果分别与Ⅰ期比较，差异有统计学意义(P<0.05)；2种方法Ⅲ期、Ⅳ期结果分别与Ⅱ期比较，差异有统计学意义(P<0.05)。EBV-DNA阳性率随着临床分期增高而增高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；VCA-IgA阳性率在各临床分期间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 2种方法在不同临床分期检测结果的比较[n(%)]

3 讨 论

鼻咽癌是1种与EBV密切相关的恶性肿瘤。目前临床应用广泛的EBV的血清标志物检测指标有VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNase和血浆EBV-DNA定量测定。前3种方法较早用于临床，但单项检测均存在一定的局限性，联合检测有较高敏感性和特异性，对鼻咽癌普查、早期诊断有临床意义[5-6]。血浆EBV-DNA定量测定较晚用于临床，但对鼻咽癌的诊断及预后预测有更大优势[7-9]。

TNM分期指导下的个体化综合治疗已成为肿瘤治疗的规范。由于核磁共振成像(MRI)广泛用于临床及对鼻咽癌生物学行为的不断了解，国内确立了基于MRI的鼻咽癌“中国2008TNM分期”，不过目前关于鼻咽癌临床分期均缺乏分子生物学指标。本研究500例患者资料中，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数与T分期显著相关(χ2=37.31，P=0.000)。随着T分期的进展，血浆EBV-DNA拷贝数越高，T3期、T4期患者血浆EBV-DNA拷贝数显著高于T1期、T2期，其机制可能是受EBV感染机体内，血浆EBV-DNA拷贝数高低直接反映了EBV复制的活跃程度，随着原发灶的增大，血浆EBV-DNA拷贝数随之增大[10]。笔者结果提示T2与T3期，T3与T4期组间差异有统计学意义(P<0.05)。Zhang等[11]也证实EBV-DNA拷贝数与T分期有显著正相关关系。

鼻咽癌患者在初诊时有65.00%～80.00%患者发现癌细胞转移。本研究中鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数与N分期有显著相关性(χ2=61.77，P=0.000)，笔者认为随N分期的递增，患者血浆EBV-DNA拷贝数增高，N0分期EBV-DNA拷贝数最低，N3分期EBV-DNA拷贝数最高。有学者报道血浆EBV-DNA拷贝数与N分期呈正相关关系，从另一个角度说明血浆EBV-DNA拷贝数越高，淋巴转移越广泛。本研究发现，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数与M分期有显著相关性(χ2=71.82，P=0.000)，研究结果显示M1分期EBV-DNA拷贝数高于M0分期(P<0.05)，其机制可能与血浆EBV-DNA拷贝数与转移的肿瘤负荷有关， EBV-DNA可能由肿瘤细胞释放进入外周血，随着病情的进展，血浆中EBV-DNA拷贝数会相应增加，Zhang等[11]报道鼻咽癌远处转移患者血浆EBV-DNA拷贝数显著高于无远处转移者。

本研究评价荧光定量PCR和ELISA 2种方法对鼻咽癌的诊断价值。荧光定量PCR具有常规PCR的高敏感性，能克服常规PCR技术不能定量及易污染问题；此外，采用荧光探针，可直接探测到PCR扩增中荧光信号变化，实现实时荧光定量检测。研究中发现，荧光定量PCR方法测定EBV感染阳性率显著高于ELISA血清学方法，且阳性率随着鼻咽癌进展而增加。近年来，有学者认为荧光定量PCR法对鼻咽癌分期诊断有较高的敏感性[12]，可作为鼻咽癌预后评价指标之一，而ELISA方法对鼻咽癌分期诊断敏感性较低。笔者研究显示，ELISA方法检测EBV感染阳性率显著低于荧光定量PCR方法且对分期并不敏感。ELISA方法作为医院免疫室常规检测方法，与荧光定量PCR方法比较价格相对低廉、无需特殊设备，但操作较繁琐、主观性强，只适用于大规模人群筛查。

综上所述，血浆EBV-DNA拷贝数与鼻咽癌TNM的临床分期呈正相关，鼻咽癌TNM分期越高，患者血浆EBV-DNA拷贝数越高。因此，血浆中EBV-DNA拷贝数可在分子水平上反映鼻咽癌患者的病情程度，对鼻咽癌的预后评价具有较大的临床意义[13]。

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Diagnostic value of Epstein-Barr virus DNA detection in the clinical staging of patients with nasopharyngeal carcinoma*

GUANZhenqi1,HEFengping1△,QIUShijie2#,ZHANGXiangguo1,MAZhanzhong1,LIUYulan1,GUOYanle1,ZHANGHelin1,ZHANGSi1

(1.YuebeiPeople′sHospitalAffiliatedtoShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,Guangdong512026,China;2.GuangdongMedicalUniversity,Shantou,Guangdong523770,China)

Objective To discuss the diagnostic value of Epstein-Barr virus DNA(EBV-DNA) detection in the clinical TNM staging of patients with nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods A total of 500 patients with NPC were selected as research group from March 2013 to December 2015 analyzed.At the same time,200 healthy people were chosen as control group.By real time quantitative PCR,the level of EBV-DNA in plasma was detected in all the subjects and compared between the two groups as well as between Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ staging.In addition,using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),serum EBV coat antigens-IgA(VCA-IgA) were detected.Results The positive rate of plasma EBV-DNA in research group(75.00%) was significantly higher than that of control group(9.00%,P<0.05).The copy numbers of plasma EBV-DNA in patients with NPC was positively correlated with TMN staging(P<0.05),the later the TNM staging,the more the copy numbers of plasma EBV-DNA.Conclusion The plasma level of EBV-DNA is correlated with TNM staging of patients with NPC.Detection of plasma EBV-DNA is valuable for the diagnosis of NPC which can be used as an auxiliary molecular biological index for TNM staging.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus; TNM staging; real time quantitative PCR

华南肿瘤学国家重点实验室开放基金(HN2014-07)；广东省韶关市卫生和计划生育局立项项目(Y15070)。

管振祺，男，主管技师，主要从事分子肿瘤学方面的研究。

△通讯作者，E-mail:fengphe@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.005

A

1673-4130(2016)21-2961-03

2016-02-01

2016-04-21)

#共同第一作者。何凤屏，女，主任技师，主要从事分子肿瘤学方面的研究。