女性外阴尖锐湿疣组织中HPV感染型别的回顾性研究*

单慧敏，曹佩霞，耿建祥，蔡为民，施启丰，龙秀荣，夏 林，王宏景，赵 雪

(1.江苏省大丰市人民医院病理科 224100；2.江苏省常州市中医医院妇产科 213003；3.南京中医药大学第三附属医院病理科/江苏省HPV协作组 210001；4.江苏省常熟市第一人民医院病理科 215500)



·论 著·

女性外阴尖锐湿疣组织中HPV感染型别的回顾性研究*

单慧敏1，曹佩霞2，耿建祥3△，蔡为民4，施启丰3，龙秀荣3，夏 林3，王宏景3，赵 雪3

(1.江苏省大丰市人民医院病理科 224100；2.江苏省常州市中医医院妇产科 213003；3.南京中医药大学第三附属医院病理科/江苏省HPV协作组 210001；4.江苏省常熟市第一人民医院病理科 215500)

目的 探讨女性外阴尖锐湿疣(外阴CA)组织中人乳头瘤病毒(HPV)感染型别的分布状况及临床意义。方法 采用基因芯片结合聚合酶链式反应(PCR)技术对322例外阴CA组织行23种HPV基因型检测，并分析患者的临床病理资料。结果 322例外阴CA组织中检出HPV阳性者279例，HPV感染率为86.65%(279/322),单一型感染率56.52%(182/322)，多型感染率30.12%(97/322)。结论 HPV感染与外阴CA的发病密切相关,HPV 11和6型是单一型感染最主流的型别，而11+18、11+16、6+11和6+16型是多型感染最常见型别。基因芯片联合PCR技术适用于临床开展HPV分型诊断，敏感性好、特异性高，对女性外阴CA的临床诊断、治疗及其疫苗研究意义重大。

外阴； 组织； 尖锐湿疣； 人乳头瘤病毒； 基因分型

外阴部湿疣性病变主要包括尖锐湿疣(CA)和扁平湿疣，两者均由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致，仅在病理组织形态学上存在某些差异性[1-4]。扁平湿疣比CA更为常见，但由于其病变扁平而不显著，没有引起临床医师和患者的重视。由于HPV感染普遍，CA病变显著，且通过性传播引起，因此，临床上女性外生殖器CA十分常见。目前，国内女性外生殖器CA组织中HPV感染分型研究的大样本资料十分匮乏。本研究采用聚合酶链式反应(PCR)联合基因芯片技术，以23种常见高危型和低危型HPV作为感染源，对322例女性外阴CA组织标本进行25年的回顾性基因分型研究，并对其患者外阴CA组织中HPV感染基因型及年龄分布状况进行分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取1991年9月至2015年12月南京中医药大学第三附属医院和江苏省常熟市第一人民医院妇产科手术切除的女性外阴CA病变常规石蜡组织标本322例，年龄17～69岁，中位数30.38岁；20岁以下10例，20～29岁179例，30～39岁69例，40～49岁43例，50～59岁14例，60～69岁7例。由2位病理医师结合临床，依据外阴CA病变大体和显微镜组织形态学特征作出符合外阴CA的诊断，并复习其临床病理资料。

1.2 仪器与试剂 HPV基因分型检测试剂盒购自深圳亚能公司；基因扩增仪为Gene Amp PCR system 2400型，购自新加坡；分子杂交仪为FYY-3型，购自江苏省兴化分析仪器厂；高速冷冻离心机为Eppendorf 5810 R型，购自德国；生物安全柜为BHC-1300ⅡA2型，购自苏州安泰公司；-20 ℃冰箱购自青岛海尔公司。显色液须即用即配，根据需要的水平用蒸馏水调配。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有外阴CA石蜡组织标本：先去除每例石蜡组织周边多余的石蜡，将其石蜡组织切成4 μm厚的切片，切3～5例石蜡组织即可。用专用镊子轻轻夹取，放入小离心管中，切第2例石蜡组织前，用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。

1.3.2 DNA的提取 将切下的石蜡组织片放入1.5 mL离心管中，加入裂解液150 μL，充分振荡混匀，然后在金属浴中加热100 ℃ 10 min，立即13 000 r/min离心10 min后，取中间层DNA溶液待用。PCR扩增、杂交、孵育和显色按说明书进行规范操作。每例标本显色后根据杂交信号的有无判断结果。

1.4 统计学处理 外阴CA组织中HPV感染率及各HPV型别的比例采用HPV分型统计软件(由南京倍宁医疗器械有限公司提供)进行分析，对分析出来的相关数据，采用统计软件包SPSS13.0对相关数据进行统计学处理，率的比较采用χ2检验或确切概率法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

从322例外阴CA石蜡组织标本中检测出HPV阳性者279例，阴性者43例，总HPV感染率86.65%(279/322)。其中单一型HPV感染者182例，占总HPV感染率56.52%(182/322)，单一型HPV感染中，HPV 11型97例,其阳性检出率为30.12%(97/322)，是最主要感染型别；其次为HPV 6型76例,其阳性检出率为23.60%(76/322)；HPV 16型4例,其阳性检出率为1.24%(4/322)。多型HPV感染者97例,其HPV感染率为30.12%(97/322)，多型HPV感染中，HPV 11+18型8例、HPV 11+16型6例、HPV 6+11型5例和HPV 6+16型4例,分别占多型感染的8.25%(8/97)、6.19%(6/97)、5.16%(5/97)和4.12%(4/97),是多型感染的最主要型别。2种型感染者57例，3种型感染者25例，4种型感染者9例，5种型感染者3例，6种型感染者3例。322例外阴CA患者HPV阳性检出不同型别出现频率数合计440次，其中低危型HPV出现频率313次，高危型HPV出现频率127次。见表1、2。

表1 外阴CA HPV感染者不同型别感染出现频率及比例[n(%)]

表2 外阴CA 不同年龄组HPV感染者感染人数及比例[n(%)]

3 讨 论

生殖器部位CA是全球流行最广的性传播性疾病之一。在我国CA已成为仅次于淋病的性传播性疾病。随着我国避孕套的广泛使用，国内女性外生殖器CA的发病率呈逐步下降趋势。CA病原体为HPV，因此，女性在患外阴CA时，大都伴有阴道和宫颈CA。HPV是1种小分子环状双链DNA病毒，对人体皮肤和黏膜具有高度亲嗜性，根据其L1基因序列的差异性，目前已经发现HPV有200多种型别、亚型和变异体，其中感染泌尿生殖道的HPV约有50种。按照HPV致瘤致癌的差异性，将其分为高危型和低危型。低危型一般为HPV 6、11、42、43、44、81型等，是诱发各种疣类病变和低度上皮内瘤变的主要病原体；高危型主要有HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型等，是致高度上皮内瘤变和宫颈癌的重要病原体[1，5-7]。现研究证实，高危型HPV比低危型HPV更容易导致女性的持续性感染，是引起女性宫颈瘤变和癌变的主要致病因素[8-9]。由于HPV致病性的强弱与其型别密切相关，因此，研究我国女性外阴CA组织中HPV的型别及其比例，对HPV感染相关疾病的诊断、治疗、试剂及疫苗的研发都具有重要临床意义。

CA肉眼所见常呈多部位发生或1个部位多个病灶，表现为灰红或灰褐色细颗粒型的疣状、乳头状或菜花状突起，或呈扁平斑块状突起，质硬。镜下所见典型CA病变具有以下特征：(1)鳞状上皮呈疣状、乳头状增生，常伴有上皮脚(钉突)延长、增宽，甚至呈假上皮瘤样增生。(2)鳞状上皮表皮角化不全，常伴有角化不全层细胞核增大及轻度异型。(3)棘细胞层及基底细胞层可见不同程度增生肥厚。(4)表皮内可见挖空细胞,此为CA的特征性病变。(5)真皮乳头部毛细血管增生扩张，血管上移靠近表皮。(6)真皮质内有数量不等的慢性炎性细胞浸润，可见少数中性及嗜酸性白细胞。目前，CA的病理诊断主要是依据患者病史、组织学特征和基因检测相结合的诊断模式[5，10-11]。因此，熟悉并掌握其病变的组织学特征是明确CA诊断的重要环节。

本研究显示：(1)322例外阴CA患者中，HPV阳性者279例，阴性者43例，总HPV感染率86.65%(279/322)，其中单一型HPV感染者182例，占总HPV感染率的56.52%(182/322)。单一型HPV感染中，HPV 11型97例，其阳性检出率为30.12%(97/322)，是最主要感染型别；其次为HPV 6型76例,其阳性检出率为23.60%(76/322)；HPV 16型4例，其阳性检出率为1.24%(4/322)。多型HPV感染者97例,其HPV感染率为30.12%(97/322)，多型HPV感染中，HPV 11+18型8例、HPV 11+16型6例、HPV 6+11型5例和HPV 6+16型4例,分别占多型感染的8.25%(8/97)、6.19%(6/97)、5.16%(5/97)和4.12%(4/97)，是多型感染的最主要型别。(2)322例外阴CA组织中单一型HPV感染者182例，多型HPV感染者97例。外阴CA组织中单一型和多型感染之比为1.88∶1.00；与蔡为民等[5]报道的宫颈CA组织中单一型和多型感染比相(2.83∶1.00)比较，宫颈CA组织的单一型HPV感染比例显著升高，此结果是否与女性生殖道内外环境作用相关，仍需要大样本研究加以证明。(3)从外阴CA组织HPV感染分类来看，322例外阴CA患者中，低危型HPV感染者192例，高低危型HPV感染者80例，高危型HPV感染者7例，表明外阴CA组织中HPV感染呈低危型感染、高低危型、高危型感染人数逐步降低，提示外阴CA组织是以低危型感染为主，高低危型感染为次，高危型感染为末的感染模式。外阴CA伴高危型HPV感染者占HPV总感染的31.18%(87/279)，值得关注。(4)自2006年，西方国家开始使用预防性HPV疫苗[1,12-13]。目前中国大陆地区尚未使用预防性HPV疫苗。如我国使用第1代预防性HPV疫苗(HPV 6、11、16、18型预防性四价疫苗)可保护本研究中72.40%(202/279，单一型感染者177例，多型感染者25例)外阴CA女性。HPV感染者因HPV感染而诱发外阴CA，过半女性外阴CA感染者可从中受益。(5)CA是由HPV感染所致，通过性接触或其他方式交叉感染而发病。其发病高峰年龄为20～30岁。70%为30岁以下患者，但老年及儿童亦可染病[14-15]。本研究中，小于20岁组患者比例为3.11%，20～29岁组为55.59%，30～39岁组为21.43%，40～49岁组为13.35%，50～59岁组为4.35%，60～69岁组为2.17%，提示20～29岁组单一型、多型和总感染都处于感染高峰值。6组年龄段比较，小于20岁组、50～59岁组、60～69岁组组间比较差异无统计学意义(χ2分别为0.69、0.54、2.41，P>0.05)，其他各组之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这可能与20～49岁女性处于性活跃期有关，其中20～29岁组HPV感染率最高。随着女性年龄增加，性活动减少，HPV感染率降低，致外阴CA患者比例下降。30岁以下CA患者占58.70%，40岁以下CA患者占80.13%，表明外阴CA患者主要人群可推至39岁。(6)322例外阴CA HPV感染者中，低危型出现频率314次，高危型出现频率127次，低高危型感染频率比为2.47∶1.00。虽然外阴CA以低危型HPV感染为主，但高危型HPV感染出现频率超过1/4。由于外阴CA与性活动有关，HPV在感染外阴的同时，也伴有女性阴道和宫颈HPV感染。对伴有高危型HPV感染的外阴CA患者，特别是30～49岁年龄段女性而言，高危型HPV感染是致高级别鳞状上皮内瘤变和鳞状细胞癌的重要因素。因此，应对外阴CA行HPV分型检测，如发现有高危型HPV感染，即对患者行宫颈HPV分型检测，了解其感染情况，可浓缩高风险人群，有利于妇产科医师缩小随访HPV感染的外阴CA患者范围，便于医师对外阴CA病变发展趋势做出正确预判。(7)本研究外阴CA组织中HPV感染率为86.65%，并未达到90.00%，有以下影响因素：本研究使用的部分石蜡组织标本保存时间超过20年，可能导致其石蜡组织中的HPV DNA碎片化，无法正确检测；制作包埋的病变石蜡组织标本需要经过脱水、浸蜡和包埋等高温处理过程，可能会引起部分石蜡组织内的HPV DNA降解；由于外阴CA发生在外阴皮肤，容易发现，某些石蜡组织小，可能导致HPV DNA拷贝数达不到检测最低拷贝数；本研究检测试剂只包含23种高低危型HPV，可能存在23种以外的HPV型别；目前，HPV检测大量用于宫颈细胞检测，而石蜡组织只作为科研研究，使得各种组织HPV DNA的提取方法间存在一定差异性，影响HPV检出率；本研究检测试剂的敏感性约为95.00%，存在少量HPV感染者漏检。

总之，女性外阴CA是1种性传播性疾病，病原体为HPV，以低危型HPV感染为主，高低危型HPV感染为辅，伴有少量高危型HPV感染。HPV感染与鳞状上皮内瘤变的发生发展有着密切关联。鳞状上皮内病变可单独发生，也可在CA病变中发生。外阴CA可合并外阴上皮内瘤变、宫颈上皮内瘤变(CIN)，常见外阴CA合并CINⅠ～Ⅱ级。本研究HPV感染者中有31.18%伴有高危型HPV感染，应引起临床妇产科医师高度关注。女性外阴CA治疗后，周围皮肤中仍存在HPV抗原和HPV DNA，可能为外阴CA复发根源。另有部分外阴CA患者可继发鳞状上皮细胞癌变，主要由高危型HPV感染所致，常见HPV 16、HPV 18型等型别[16-17]。因此，妇产科医师需对外阴CA患者行外阴CA病变活组织检查，明确诊断，及时发现有无伴有癌情况，对HPV 16和HPV 18型感染患者，即使其活组织检查正常，也要给予定期随访。这有利于临床妇产科医师对女性外阴CA患者疾病发展趋势作出正确预判，了解外阴CA患者宫颈HPV感染状态，以便追踪和随访[18-20]。临床上患者如用鬼臼脂治疗CA，可引起病变组织细胞异型性和非典型增生，易误判为鳞状细胞癌，故医师需了解患者病史便于做出正确病理诊断。

[1]耿建祥,王旭波.人乳头瘤病毒检测及其临床应用[M].北京:人民卫生出版社,2009:381-427.

[2]周伟,耿建祥,韩惦梅,等.原位杂交HPV DNA检测技术应用及体会[J].临床与实验病理学杂志,2009,25(4):446-447.

[3]张金浩,耿建祥,樊志敏,等.肛管及肛门区尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒基因类型的研究[J].医学研究生学报,2011,24(11):1129-1132.

[4]张金浩,耿建祥,樊志敏,等.257例肛门及肛管尖锐湿疣组织中HPV感染的基因分析[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(5):520-523.

[5]蔡为民,阚延静,耿建祥,等.宫颈尖锐湿疣组织中HPV感染基因型别分布的研究[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(4):395-399.

[6]朱小珏,耿建祥.308例宫颈瘤组织中HPV感染基因型分布的对比研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(23):3180-3182.

[7]梁晓东,蔡为民,耿建祥,等.宫颈正常细胞与ASC-US中HPV感染型别的对比研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(13):1699-1701.

[8]魏谨,耿建祥,朴正爱,等.已婚女性宫颈细胞中人乳头状瘤病毒感染的基因分型研究[J].中华医院感染学杂志,2012,22(23):5202-5205.

[9]施启丰,韩春荣,耿建祥,等.女性宫颈人乳头瘤病毒多重感染的基因型对比研究[J].中华医院感染学杂志,2014,24(19):4708-4710.

[10]唐永发,耿建祥,张金浩,等.196例肛门及肛管尖锐湿疣病变中HPV感染的研究[J].国际检验医学杂志,2012,33(11):1303-1304.

[11]曹嬿,邵馨,耿建祥,等.287例肛门及肛管尖锐湿疣组织HPV感染基因型的研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(8):969-970.

[12]徐妍婷,蔡为民,耿建祥,等.健康妇女及宫颈癌瘤患者HPV感染基因型分布的研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(22):3022-3024.

[13]夏林,龚培尧,耿建祥,等.徐州地区女性宫颈细胞中HPV感染基因型分析[J].国际检验医学杂志,2015,36(7):882-884.

[14]徐建妹,张金浩,耿建祥,等.女性肛门尖锐湿疣组织中HPV感染的回顾性研究[J].中国妇幼保健,2015,30(31):5329-5331.

[15]张金浩,蔡为民,耿建祥,等.女性肛门及肛管尖锐湿疣组织HPV感染基因型谱的分析[J].国际检验医学杂志,2015,36(1):30-32.

[16]赵敏,董汉生,陈雷,等.尖锐湿疣组织HPV基因芯片分型及型别分析[J].中国皮肤性病学杂志,2006,20(8):490-491.

[17]蔡为民,王宏景,耿建祥,等.宫颈正常细胞和宫颈鳞状细胞癌及腺癌组织中HPV感染基因型的分布[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(8):854-857.

[18]龙秀荣,王志蕙,耿建祥,等.健康妇女及宫颈上皮癌瘤患者HPV感染基因型分布特征研究[J].国际检验医学杂志,2012,33(24):2958-2959.

[19]Bruni L,Diaz M,Castellsague X,et al.Cervical human papillomavirus prevalence in 5 continents:meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings[J].J Infect Dis,2010,202:1789-1799.

[20]Li H,Wang XB,Geng JX,et al.Clinical study of styping detection of human papillomavirus(HPV) infection with microarray from paraffinembedded specimens of cervical cancer and precursor lesions[J].J Nanosci Nanotechnol,2015,15(9):6423-6428.

HPV infection types in female vulva condyloma acuminate:a retrospective study*

SHANHuimin1,CAOPeixia2,GENGJianxiang3△,CAIWiemin3,SHIQifeng3,LONGXiurong3,XIALin3,WANGHongjing3,ZHAOXue3

(1.DepartmentofPathology,People′sHospitalofDafengCity,Dafeng,Jiangsu224100,China;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,TraditionalChineseMedicineHospitalofChangzhou,Changzhou,Jiangsu213003,China;3.DepartmentofPathology,theThirdAffiliatedHospitalofNanjingTraditionalChineseMedicalUniversity/HPVCollaborationofJiangsuProvince,Nanjing,Jiangsu210001,China;4.DepartmentofPathology,theFirstPeople′sHospitalofChangshuCity,Changshu,Jiangsu215500,China)

Objective To discuss the distribution of human papillomavirus(HPV) genotypes in tissues of condyloma acuminate(CA) of vulva and its clinical significance.Methods Gene chips and polymerase chain reaction(PCR) technology were utilized for the detection of 23 kinds of HPV genotypes in vulva CA tissue specimens from 322 cases.And pathological data of all subjects were analyzed.Results In 322 women with vulva CA,the infection rate of HPV was 86.65%(279/322).Single genotype infection rate of HPV was 56.52%(182/322) and multiple genotypes infection rate of HPV was 30.12%(97/322).Conclusion HPV infection is intimately related to aetiological agent of vulva CA.HPV11 and HPV 6 genotype are main single type infection.Moreover,HPV 11+18,HPV 11+16,HPV 6+11 and HPV 6+16 are the most common types in multiple types′ infection.Gene-chips combined polymerase chain reaction(PCR) technology are the method which is applicable to HPV typing diagnosis for clinical application,and the method has high sensitivity and specificity.Detection of HPV genotypes could be used to clinical diagnosis and treatment of vulva CA,which can also be used to supply reference for the research and development of HPV vaccine in women.

vulva; tissue; condyloma acuminate; human papillomavirus; genotype

江苏省南京市卫生和计划生育委员会中医专项资助项目(2009-92)。

单慧敏，女，副主任医师，主要从事HPV感染相关性疾病的研究。

△通讯作者，E-mail：dyc720@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.008

A

1673-4130(2016)21-2970-04

2016-05-04

2016-06-24)