荧光定量PCR快速筛查脊髓性肌肉萎缩症smn1致病基因携带者*

邓坤仪,彭建明,范汉恭,李丽莲,向燕群

(南方医科大学附属中山博爱医院检验科，广东中山 528403)



·论 著·

荧光定量PCR快速筛查脊髓性肌肉萎缩症smn1致病基因携带者*

邓坤仪,彭建明,范汉恭,李丽莲,向燕群

(南方医科大学附属中山博爱医院检验科，广东中山 528403)

目的 采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测脊髓性肌肉萎缩症(SMA)运动神经元生存基因1(smn1)基因拷贝数，快速筛查SMA致病基因携带者。 方法 采用荧光定量PCR技术检测经多重连接探针扩增技术(MLPA)确认的21例SMA携带者、79例健康人群标本,及另200例本地人群标本。 结果 21例SMA携带者及79例健康人群标本检测结果与MLPA符合率均达100.0%；200例本地人群标本中，4例smn1基因拷贝数为1(为携带者)，占2.0%；173例smn1基因拷贝数为2，占86.5%；23例smn1基因拷贝数为3，占11.5%。 结论 荧光定量PCR技术是1种快速、简便和准确的SMA致病基因携带者检测技术。

荧光定量PCR； 脊髓性肌肉萎缩症； 运动神经元生存基因1

脊髓性肌肉萎缩症(SMA)是常染色体隐性遗传性神经肌肉病，居致死性常染色体隐性遗传病第2位，仅次于囊性纤维变性[1]，人群中发病率为1/6 000～1/10 000。最近报道中国人群SMA致病基因的携带者频率为1/42[2]。位于染色体5q11.2～q13.3 上的运动神经元生存基因(smn)是SMA的主要致病基因，其具有2个高度同源的拷贝smn1和smn2，两者仅有5个碱基差别，分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中。既往研究已证实，90%以上的SMA为smn1基因缺失所致[3]，检测smn1拷贝数可以确诊SMA患者和携带者[4]。SMA基因目前多采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术及多重连接探针扩增技术(MLPA)进行诊断[5-6]，两者操作都比较繁琐，需要特定仪器及有经验的操作人员。本研究拟采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术，定量检测smn1基因拷贝数，可简单快速进行SMA携带者检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从中山市博爱医院检验科收集2015年1～6月乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周全血标本300例。男性167例，女性133例；年龄18～51岁，平均(31.6±10.8)岁；其中100例经MLPA确认smn1拷贝数，21例为SMA携带者，79例为健康人群；另200例标本为随机收集，用于分析本地区表观健康人群SMA致病基因携带者频率调查。所有标本采用传统酚-氯仿法抽提外周血基因组DNA。

1.2 方法 扩增smn1及清蛋白12号外显子的引物由赛默飞世尔中国有限公司合成，扩增smn1引物序列如下：上游引物R1，5′-CCT TTT ATT TTC CTT ACA GGG TTT C-3′；下游引物R2，5′-GAT TGT TTT ACA TTA ACC TTT CAA CTT TT-3′。采用人血清清蛋白12号外显子作为参比基因，扩增清蛋白引物序列如下：上游引物R3，5′-AGC TAT CCG TGG TCC TGA AC-3；下游引物R4，5′-TTC TCA GAA AGT GTG CAT ATA TCT G-3′。采用罗氏LightCycler480扩增仪进行检测，总反应体积20 μL，10 μL LightCycler480 SYBR Green I Master，20 ng基因组DNA(8 μL)，分别在不同反应管中加入0.1 μmol/L 和0.5 μmol/L smn1和清蛋白引物。扩增条件为95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，共40个循环。每个标本平行测定3次。

1.3 统计学处理 采用2-△△Ct数学模型进行结果计算。在每次检测待测标本时，同时检测1～3例健康标本，分别计算待测标本及健康标本待测基因与参比基因Ct的差值(△Ct)，再将待测标本的△Ct减去健康标本的△Ct，得到△△Ct，计算2-△△Ct即可得到待测标本相对于健康标本目的基因的相对拷贝数,2-△△Ct结果为1.0即为健康人群，为0.5即为SMA致病基因携带者，为0即为SMA患者。

2 结 果

2.1 已知基因型标本荧光定量PCR 检测结果 经MLPA检测基因型已知的21例SMA携带者标本及79例健康对照标本，通过荧光定量PCR分析检测结果与MLPA法符合率达100.0%，见表1。

表1 已知基因型标本荧光定量PCR检测smn1结果

2.2 本地人群标本smn1基因拷贝数结果 200例本地人群标本中，smn1基因拷贝数为1的有4例，其2-△△Ct值为0.39～0.56，携带者频率为2.0%；其余标本2-△△Ct值为0.87～1.69，绝大部分smn1基因拷贝数为2，见表2。

表2 本地人群标本荧光定量PCR检测smn1结果

3 讨 论

根据SMA发病年龄和病情严重程度不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型:其中Ⅰ型SMA，患儿于出生后6个月内发病，不能独坐，多于2岁内死于呼吸功能不全；Ⅱ型SMA，出生后6～18个月发病，患儿可独坐，但不能独立行走，大多能存活2年以上；Ⅲ型SMA，出生18个月后发病，呈慢性进展，可以保持独立行走和站立的能力，一般在成年后死亡。近年来有人提出存在Ⅳ型(或称成人型)SMA，此型SMA非常少见，病情轻微。4种SMA都可能由smn1发生缺失、重排或小的基因内突变所致。大部分健康人smn1拷贝为2，约5%的健康个体有3个smn1拷贝，携带者smn1拷贝数为1[7]。smn2是与smn1高度同源的基因，是SMA患者临床表型的调节基因，其拷贝数越多，产生的全长转录产物也越多，可部分补偿SMN蛋白不足，减轻SMA患者临床表现，也可预测SMA患儿病程进展[8]。提高smn2产生全长SMN2蛋白量是日后对SMA进行基因治疗的研究方向。

荧光定量PCR对于smn1基因的检测，主要是比较标本中smn1基因与健康对照的相对量以推定其拷贝数，所以采用无需标准品的相对定量方法。由于缺失1个smn1基因标本与未缺失标本之间基因的拷贝数差异仅为1倍，体现在Ct值上的变化非常小，需要恰当的数据处理模式将这种微小的差异检测出来。采用2-△△Ct数据处理模式，每次检测标本时同时检测1～3例健康对照标本，分别计算待测标本及健康对照标本的△Ct(目的基因减去参比基因Ct值)，将待测标本△Ct减去健康对照标本△Ct，得到△△Ct，然后计算2-△△Ct，得到目的基因相对参比基因的拷贝数。这种目的基因相对定量模式，无需制备标准曲线，可灵敏地检测出基因拷贝数的差异。

笔者筛查了200例本地人群标本，发现4例smn1基因拷贝数为1的SMA携带者，与之前关于中国人群SMA致病基因携带者频率的报道相近[1,9]，smn1基因拷贝数为2的标本有173例，占86.5%，smn1基因拷贝数为3的有23例，占11.5%。

由于患者来源限制，本研究没有检测SMA患者标本，也没有检测SMA患儿父母的标本。本研究采用与MLPA进行比较的方法来验证当前方法。对经MLPA法检测基因型已知的21例SMA携带者标本及79例健康人群标本，荧光定量PCR分析所检测的结果与MLPA的相符率达100.0%。MLPA是1种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和半定量分析的新技术，该技术可对待测基因所有外显子的缺失及重复状况进行检测，结果准确，目前国内外众多学者均将其用于SMA的基因检测[6,10]。不过，其方法存在操作繁琐，对操作人员要求较高等缺陷。荧光定量PCR方法操作简单，可以大批量进行检测，结果准确。

SMA目前尚无有效的治疗手段，病情严重，将对患者家庭和社会带来沉重负担。本院负责全市大多数人口的婚前医学检查和孕前优生健康检查，探索1个适合本地区的SMA筛查方法，并通过检测SMA携带者，对高危夫妇进行婚姻及生育指导，对有效降低SMA发病率、提高人口素质有重要意义。

[1]Labrum R,Rodda J,Krause A.The molecular basis of spinal muscular atrophy(SMA)in South African black patients[J].Neuromuscul Disord,2007,17(9/10):684-692.

[2]Zhu S,Xiong F,Chen YJ,et al.Molecular characterization of SMN copy number derived from carrier screening and from core families with SMA in a Chinese population[J].Eur J Hum Genet,2010,18(9):978-984.

[3]Wirth B.An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene(SMN1) in autosomal recessive spinal muscular atrophy(SMA)[J].Hum Mutat,2000,15(3):228-237.

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Application of real-time quantitative polymerase chain reaction rapid screening in spinal muscular atrophy smn1 gene carrier*

DENGKunyi,PENGJianming,FANHangong,LILilian,XIANGYanqun

(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedofSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

Objective To explore the potential of real-time quantitative PCR rapid screening in detecting spinal muscular atrophy (SMA) smn1 gene copy numbers and SMA carrier.Methods Twenty one carriers and 79 healthy controls confirmed by multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and 200 healthy adults were detected by real-time quantitative PCR.Results Coincidence rate of results of 21 carriers and 79 healthy controls detected by MLPA and real-time PCR were 100.0%.Of 200 healthy adults,4 cases had 1 copy of smn1,which accounted for 2.0%.And 173 had 2 copy of smn1,which accounted for 86.5%.In addition,23 had 3 copy of smn1,which accounted for 11.5%.Conclusion Real-time quantitative PCR is a fast,easy and accuracy technology for SMA carrier detection.

real-time quantitative PCR; spinal muscular atrophy; smn1

广东省中山市科技计划项目(20132A026)。

邓坤仪，女，副主任技师，主要从事临床医学检验方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.012

A

1673-4130(2016)21-2983-02

2016-01-30

2016-04-20)