急性双表型白血病细胞形态学和免疫表型的研究

张小芳，栗瑞敏，张运刚，李守霞

(河北省邯郸市中心医院检验科 056001)



·论 著·

急性双表型白血病细胞形态学和免疫表型的研究

张小芳，栗瑞敏，张运刚，李守霞△

(河北省邯郸市中心医院检验科 056001)

目的 探讨骨髓细胞免疫表型在急性双表型白血病中的诊断价值及其与骨髓细胞形态学的比对研究。方法 对190例急性白血病患者采用流式细胞仪四色免疫荧光直接标记技术检测细胞免疫表型，通过骨髓细胞形态学分型进行分析。采用流式细胞术四色免疫荧光直接标记技术与CD45/SSC设门分析技术检测11例双表型急性白血病患者，根据欧洲白血病免疫分类协作组(EGIL)积分标准进行免疫学分型。结果 190例急性白血病中被免疫分型诊断为急性髓系白血病88例(占46.3%),急性淋系白血病88例(占46.3%),未分化白血病3例(占1.6%)，与骨髓细胞形态学和组织化学诊断具有高符合率。190例急性白血病中被免疫分型诊断为急性双表型白血病11例(占5.8%)，其中髓系与B系共表达的抗原7例(占3.7%)，均共同表达cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表达量较高；髓系与T系共表达的抗原3例(占1.6%)，均共同表达cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表达量较高；髓系、B系与T系均表达的抗原1例(占0.5%)。此外，急性双表型白血病患者高表达CD34胞膜抗原(占81.8%)，提示预后不良。结论 急性双表型白血病发病率较低，骨髓细胞免疫表型对诊断及鉴别双表型急性白血病有特异性,以髓系和B系抗原共表达为主。采用骨髓细胞形态学和流式细胞术联合检测急性双表型白血病可提高诊断准确性，能有效地指导临床制订治疗方案和进行预后判断。

急性双表型白血病； 流式细胞术； 免疫表型； 抗原； 荧光标记技术； 细胞形态学

长期以来，临床上根据细胞形态学和组织化学染色进行分型诊断，但其分型结果已无法满足目前临床对白血病的诊断要求，尤其对于某些发病率低、治疗困难的急性白血病，如急性双表型白血病(BAL)。BAL是1种少见类型的白血病，男性多于女性，目前国内外BAL发病率较低并缺乏系统研究，要切实把握并作出正确诊断十分困难。本研究采用骨髓细胞形态学和流式细胞术(FCM)联合检测190例急性白血病患者进行免疫学分型特点，探讨骨髓细胞免疫表型对BAL未分化型及伴系表达白血病的诊断及鉴别诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年1月至2015年5月在邯郸市中心医院检验科结合骨髓涂片和FCM检测确诊为急性白血病患者190例，年龄6～68岁；男90例，女77例，平均年龄(39.7±0.5)岁。

1.2 仪器与试剂 美国BD Biosciences公司生产的流式细胞荧光分选技术(FACS) Cabibur双激光四色分选流式细胞仪、涡旋混匀器和离心机；荧光标记的单克隆抗体、FACS溶血素、FACS破膜剂均购自美国BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 原理 采用FCM检测急性白血病抗原的表达，将单克隆抗体与骨髓细胞共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后上机检测。该方法操作简便、快速、重复性好，人为因素的影响小，检测敏感性高、准确性好，能提高急性白血病的诊断率，降低误诊率。

1.3.2 标本制备 无菌条件下行骨髓穿刺，抽取0.3 mL骨髓液，涂7张片备用；再抽取骨髓细胞液1～2 mL加到肝素钠抗凝的真空采血管中颠倒混匀，置4 ℃冰箱保存，48 h内做FCM检测。

1.3.3 细胞形态学检查 细胞涂片经瑞氏-姬姆萨混合染液染色，在油镜(1 000倍)下分类计数500个细胞，按法、美、英分型(FAB分型)。每例患者的骨髓涂片均加做糖原(PAS)和过氧化物酶(POX)染色，细胞化学染色方法按本实验室常规染色进行。骨髓涂片重点观察骨髓细胞的增生程度、各系形态、分化程度及有无成簇分布现象[1-2]。

1.3.4 FCM检测 采用美国BD公司FACS Cabibur双激光四色分选流式细胞仪，Cell quest软件荧光定量分析。每例标本分析15 000个细胞，细胞在波长488 nm处检测PE的红荧光和FITC的绿荧光，分别通过575 nm和513 nm滤光片收集，Percp的荧光通过635 nm滤光片收集。采集CD45/SSC设门，分析幼稚细胞群及成熟各系细胞群，经FSC、SSC、McAb1-FITC、McAb2-PE、CD45- Percp、McAb3-APC共6个参数分析，确定免疫表型。单克隆抗体来源荧光标记的单克隆抗体包括T、B、髓系细胞系列，用2个系列或阶段特异性单抗加CD45进行四色荧光染色。单克隆抗体有：B淋巴细胞白血病包括CD20、kappa、lambda、CD19、cCD79a、CD22、CD10、cIgM； T淋巴细胞白血病包括CD4、CD8、CD3、cCD3、CD2、CD5、CD7、CD1a、TCR；NK淋巴细胞白血病包括CD16、CD56，CD57；髓系白血病包括c MPO、CD117、CD14、CD13，CD33，CD15，CD11b，CD64，CD36，CD11c；红白血病包括GlyA(血型糖蛋白A)；巨核细胞白血病包括CD41，CD42，CD61；白血病系列非特异性抗原包括CD34，CD38，HLA-DR。按FCM常规方法标记表面抗原和胞内抗原。

1.3.5 BAL诊断标准 BAL的诊断标准：世界卫生组织推荐采用修改后的欧洲白血病免疫分类协作组(EGIL)积分标准[3]。髓系细胞和淋巴系细胞(T、B系中任何1个系)标记各积2分以上便可确诊。表面抗原大于20%或胞内抗原大于10%即为阳性。

2 结 果

2.1 急性白血病的骨髓细胞形态表现 所有患者骨髓增生极度活跃或活跃，其中被诊断为急性髓系白血病(AML)90例(占47.4%)、急性淋系白血病(ALL)95例(占50.0%)、未分化白血病3例(占1.6%)、急性混合性白血病2例(占1.0%)。

2.2 急性白血病细胞免疫表型结果分析 经FCM检测，根据骨髓细胞特异性抗原的表达情况，190例急性白血病中被免疫分型诊断为AML 88例(占46.3%)，ALL 88例(占46.3%)和未分化白血病3例(占1.6%)，其与骨髓细胞形态学和组织化学诊断具有高符合率。190例急性白血病中被免疫分型诊断为BAL的11例(占5.8%)，其中髓系与B系共表达的抗原7例(占3.7%)，均共同表达cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表达量较高；髓系与T系共表达的抗原3例(占1.6%)，均共同表达cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表达量较高；髓系、B系与T系均表达的抗原1例(占0.5%)。见表1。此外，BAL患者高表达CD34胞膜抗原(81.8%)，提示预后不良。见表2。

表1 11例BAL免疫分型结果(n)

表2 CD34免疫分型结果

3 讨 论

目前国内外对白血病的临床诊断多采用细胞形态、免疫学等检测方法，可区分为AML或ALL，但有3%～8%急性白血病在同一白血病细胞群同时表达髓系和淋系相关抗原，依据免疫表型被诊断为BAL[4-7]。例如早期前体T细胞ALL免疫特征为CD7和CD3的强表达，同时异常表达CD11b、CD13、CD33、CD117和CD34等某些髓系抗原，治疗上应予以考虑[8-10]。本院诊治的190例急性白血病，其中BAL有11例，占5.8%。本研究11例BAL患者中，骨髓细胞学和化学染色考虑为急性混合性白血病的2例，AML的2例(M5b1例，M4b1例)，ALL的7例(L1型5例，L2型2例)，但被免疫表型检测后均诊断为BAL。BAL原始细胞形态并不一致，可能表现出髓系分化特征或显示淋系/未分化细胞形态特征；BAL原始细胞起源于早期造血干祖细胞，通过形态学检测很难识别未分化或微分化的原始细胞类别。免疫表型可对BAL免疫分型进行有效区分,能全面、特异、准确地检测出细胞抗原分布情况，依据细胞表达的抗原判定细胞的来源和良恶性，有利于指导临床制订治疗方案和进行预后判断[11]。因此，急性白血病的分型诊断必须结合免疫表型、细胞形态学和化学染色进行综合分析。BAL免疫表型具有异质性，包括髓系/B系、髓系/T系、髓系/B系/T系和B系/T系4种表型，大多数研究报道表明，约70%的BAL患者为髓系/B系，23%～30%的患者为髓系/T系表型，髓系/B系/T系和B系/T系表型极少见[12]。本研究经FCM检测显示，BAL的免疫分型中最常见为髓系/B系分化抗原的混合表达(占63.6%)；其次为髓系/T系分化抗原的混合表达(占27.2%)；少见髓系/B系/T系分化抗原的混合表达(仅1例，占9.1%)，与相关报道一致。髓系与B系共表达的抗原7例，均共同表达cCD79a和cMPO，胞膜抗原CD19和CD10表达量较高；髓系与T系共表达的抗原3例，均共同表达cCD3和cMPO，胞膜抗原CD5和CD7表达量较高。在本研究中，BAL细胞CD34阳性率高达81.8%，与同时期诊断的AML(占33.0%)和ALL(占35.2%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其他学者研究表明，CD34和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的阳性率超过80%[13-14]。由于CD34和TdT为干细胞特有抗原，提示BAL细胞来源于干、祖细胞。有研究报道，CD34阳性BAL患者的缓解率显著低于CD34阴性BAL患者的缓解率，表明CD34阳性是BAL预后不良指标[15]。BAL属特殊类型白血病，有其独特临床生物学特征，还涉及预后和治疗等复杂问题，不能仅对其进行简单诊断。因此，结合免疫表型、细胞形态学和化学染色对急性白血病患者进行综合分析可最大程度减少结果判断的主观性，可提高结果判断准确性，是1种可确诊BAL的简单方法。

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Analysis of cell morphology and immunophenotype in patients with biphenotypic acute leukemia

ZHANGXiaofang,LIRuimin,ZHANGYungang,LIShouxia△

(DepartmentofClinicalLaboratory,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China)

Objective To discuss the diagnostic value of myeloid immunophenotype in detection the biphenotypic acute leukemia(BAL) and to compare the value with morphology of bone marrow cells.Methods Immunophenotype of 190 patients with acute leukemia(AL) were detected by four-color direct immunofluorescence staining methods of flow cytometry(FCM).And by morphology of bone marrow cells,the immunophenotype were analyzed.Four-color direct immunofluorescence staining methods combined with CD45/SSC gating analysis was used to analyze immunophenotype of 11 cases with BAL according the standard score of EGIL.Results Among 190 cases with AL,88 cases were acute myeloid leukemia(AML),which accounted for 46.3%,and 88 cases(46.3%) were acute lymphocytic leukemia(ALL) and 3 cases(1.6%) were undifferentiated AL.These results had a high coincidence rate with morphology of bone marrow cell and tissue chemistry diagnosis.Among 190 cases with AL,11 cases(5.8%) were diagnosed of acute BAL.Amomg of them,7 cases(3.7%) expressed of B lymphoid and myeloid together which showed that both cCD79a and cMPO immunophenotyping were expressed,meanwhile the expression of membrane antigen CD19 and CD10 was higher.Three cases(1.6%) expressed T lymphoid and myeloid together which showed that both cCD3 and cMPO immunophenotyping were expressed,and the expression of membrane antigen CD7 and CD5 was higher.Only one case(0.5%) expressed B,T and myeloid.Patients with BAL showed high expression of membrane antigen CD34(81.8%) indicating poor prognosis.Conclusion The incidence of BAL is low and immunophenotype of morphology of bone marrow cells is a very specific diagnosis of BAL.The co-expression of B lymphoid and myeloid antigen is major feature of BAL.Combination detection of morphology of bone marrow cell and flow cytometry in patients with BAL could improve the diagnostic accuracy,which can effectively guide the clinical treatment and judge prognosis.

biphenotypic acute leukemia; flow cytometry;immunophenotype; antigen; fluorescent markers; cell morphology

张小芳，女，主管技师，主要从事免疫学方面的研究。

△通讯作者，E-mail：xiaofang1118@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.018

A

1673-4130(2016)21-2999-03

2016-04-30

2016-06-20)