全自动化学发光免疫分析仪检测肝纤维化指标的方法学性能验证

黄永攀　韦荣国　覃 政　李 灵　宋波权

全自动化学发光免疫分析仪检测肝纤维化指标的方法学性能验证

黄永攀①韦荣国①覃 政②李 灵③宋波权①

目的：对新产业MAGLUMI全自动化学发光免疫分析仪检测肝纤维化指标的方法学性能进行验证。方法：按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐方法测定的生物参考区间指标，采用MAGLUMI4000化学发光免疫分析仪对检测肝纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(C Ⅳ)的批内和日间精密度、准确度、线性范围及灵敏度等进行验证。结果：MAGLUMI分析仪测定HA、LN、PⅢNP、C Ⅳ批内和日间精密度变异系数(CV)分别为3.01%～4.82%和3.77%～4.69%；相对偏倚(%)为-5.3%～0.2%；测定线性范围与厂商要求相近；HA、LN、PⅢN-P和C Ⅳ的测定数值与厂商提供的参考区间符合，检测的灵敏度分别为1.30 ng/ml、0.9 ng/ml、0.49 ng/ml和0.54 ng/ml。结论：MAGLUMI化学发光免疫分析仪可直接用于对人血清中肝纤维化指标HA、LN、PⅢNP及C Ⅳ的含量进行定量分析，批内精密度、日间精密度、准确度、线性范围、灵敏度以及参考区间均较好，报告结果准确可靠。MAGLUMI分析仪是一种较理想的适用于判断肝纤维化程度的检测仪，值得推广应用。

化学发光免疫分析仪；肝纤维化指标；性能评价

[First-author’s address] Department of Clinical Laboratory, Langdong Hospital of the First People’s Hospital of Nanning, Nanning 530000, China.

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化[1-3]。肝纤维化常见检查方法有组织病理学检查、影像学诊断和血清学诊断。组织病理学检查是判断慢性肝病是否已导致肝纤维化的“金标准”，而肝活检是一种创伤性检查，存在较大疼痛和并发症风险，不方便反复取样检查，且存在取样误差[4-6]。影像学评估以超声较普遍，但目前影像学技术不能评估肝纤维化的早期阶段，具有一定局限性。血清学诊断具有取样方便，可随时多次采血、价格低以及无创伤等优势，利于早期发现，动态监测肝纤维化，是目前应用最广泛的肝纤维化检查方法[7]。

肝纤维化标志物包括透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原(C Ⅳ)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(N-terminal peptide of procollagen Ⅲ，PⅢNP)及血清甘胆酸(cholyglycine，CG)等[8]。通过对肝纤维化标志物进行血清学检测，能对慢性肝病纤维化病变发展程度进行监测。为了保证检验项目结果的质量，本研究对HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ进行检测，对MAGLUMI化学发光免疫分析仪的精密度、准确度、线性范围、灵敏度以及参考区间等性能进行验证。

1　资料与方法

1.1标本来源

收集符合肝纤维化指标标本要求的门诊或住院患者送检的标本，并按肝纤维化检测指标的要求及时分析或处理标本。

1.2仪器和试剂

MAGLUMI 4000全自动化学发光免疫分析仪(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司)，检测试剂，校准品，质控品均由深圳市新产业生物医学工程有限公司提供，并严格按照仪器及试剂说明书的操作规程进行。

1.3检测方法

按照仪器的作业指导书对仪器进行系统维护保养，待常规室内质量控制完成后按美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐方法测定HA、LN、PⅢNP和CⅣ的批内和日间精密度、准确度、线性范围、灵敏度以及生物参考区间等指标，并进行验证，且于检测过程中不定时地插入室内质控物进行质量监控，确保整个分析过程中仪器处于质量控制的良好状态。

1.3.1精密度验证

批内精密度：参照NCCI SEP5-A[11]文件，随机抽取一盒试剂，按试剂盒说明书规定检测，用各自的质控品连续重复测试20次，分别计算其均值±标准差(x-±s)和变异系数(coefficient variation，CV)值(%)。日间精密度：每日测定1次质控品，连续测定20 d，分别计算x-±s和CV值。

1.3.2准确度验证

用校准品校准检测系统后，对定值质控品进行HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ检测，检测结果与定值质控品的靶值进行对照，计算检测值与靶值的相对偏倚(%)，即为公式1：

1.3.3线性范围验证

按照美国临床实验室标准NCCISEP6-A2[12]文件评价方案，选取高值血清样本(H)和低值血清样本(L)各1份，浓度分别接近仪器给定的测量线性范围的两侧，将样本H和样本L按5 H、4 H+L、3 H+2 L、2 H+3 L、H+4 L及5 L的比例混合成6个样品，每份样品重复测定3次，计算平均值(x-)。将实测值与理论值相比较验证线性范围。

1.3.4灵敏度验证

分别取10份HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ空白液连续测定3次，取其平均值(x-)作为相应检测项目的灵敏度。

1.3.5参考区间验证

按照NCCIS C28-A2文件[13]要求进行验证。选择健康人群标本20份，在MAGLUMI 4000分析仪上进行测定，对结果进行统计并与仪器说明书提供的参考范围比较。测定HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ项目，要求20个检测数据中只允许有1个数据在给定的生物参考区间之外，否则需要进行检测项目参考范围的建立。

表1　MAGLUMI 4000分析仪测定肝纤4项精密度(%)

2　结果

2.1精密度

MAGLUMI 4000分析仪检测HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ批内精密度分别为3.01%、3.90%、3.70%和1.81%，日间的精密度分别为3.86%、4.69%、4.01%和3.77%，均符合要求，见表1。

2.2准确度

MAGLUMI 4000分析仪检测HA、LN、PⅢPN-P和C Ⅳ的校正品结果与靶值的相对偏倚分别为0.09%、-4.4%、0.2%和-5.3%，均在MAGLUMI 4000分析仪允许范围内。

2.3线性范围

MAGLUMI 4000分析仪检测HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的线性范围分别为4.46～1986.99 ng/ml，2.00～999.25 ng/ml，0.50～1983.34 ng/ml和2.00～1990.21 ng/ml，均符合要求。与厂商提供的线性范围相近，表明厂商提供的线性范围可靠，可直接用于临床。

2.4灵敏度

MAGLUMI 4000分析仪检测HA、LN、PⅢPN-P和C Ⅳ灵敏度分别为1.30 ng/ml、0.9 ng/ml、0.49 ng/ml和0.54 ng/ml，与厂商提供的灵敏度相一致。

2.5参考区间

MAGLUMI 4000分析仪检测HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的结果均与仪器厂商提供的参考区间符合，仪器厂商提供的参考区间适合本地区人群。

3　讨论

肝纤维化标志物HA主要由间质细胞合成，经淋巴循环入血，由肝脏内皮细胞摄取，由特异的HA酶水解，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标。LN广泛分布于基底膜的透明层，紧贴细胞基底部，与C Ⅳ结合形成基底膜股价，影响细胞的粘附、运动，调节细胞生长和分化，并与肝纤维化发生、肿瘤的浸润转移等有关。Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)是PⅢNP的前体，PC Ⅲ分泌到细胞外后，经内切酶酶切后裂解下来的氨基端多肽形成PⅢNP，PⅢNP在肝纤维化早期即可能升高，血清含量与肝纤维化程度一致。C Ⅳ为构成基底膜主要成分，在细胞内合成，直接以前胶原形式参与细胞外间质的构成。正常肝脏C Ⅳ含量极微，肝脏发生纤维化后，早期即见其增生，且转换率快，最后与持续沉积的层粘连蛋白形成完整的基底膜。血清C Ⅳ水平升高可较灵敏反映出肝纤维化过程，在肝纤维化时出现最早，是肝纤维化的早期标志之一[7-10]。

肝脏遭到各种致病原侵袭时，引起肝脏损害与炎症反应，肝组织免疫系统同时被激活，进行组织修复。肝纤维化是指这种组织修复过程过度及失控时，肝组织内细胞外基质过度增生与异常沉积所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程[14-15]。HA是基质成分，可较准确灵敏的反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损情况。有资料认为，血清HA动态检测较之肝活检更能完整反映出肝全貌，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标，尤其在肝纤维化时，血清HA升高幅度与病变程度相关。LN为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，此外，LN水平越高肝硬化患者的食管静脉曲张越明显。正常肝脏间质含少量LN，在肝纤维化和肝硬化时，肌成纤维细胞增多，大量合成和分泌胶原、LN等间质成分，形成完整的基底膜。PⅢNP反映肝内Ⅲ型胶原合成，血清含量与肝纤维化程度一致。持续PⅢNP升高的慢性活动性肝炎，提示病情可能会恶化并向肝硬化形成发展，而PⅢNP降至正常可预示病情缓解。C Ⅳ为构成基底膜主要成份，反映基底膜胶原更新率，含量增高可较灵敏反映出肝纤维化过程[16-18]。

目前，测定肝纤维化四项血清含量的方法主要有化学发光法和放射免疫分析法。有研究表明，化学发光法是检测血清肝纤维化四项较为特异和准确的方法，其效果明显优于放射免疫分析法[9]。新产业MAGLUMI化学发光分析仪，运用先进的直接化学发光检测技术，具有准确度高、重复性好、线性范围广、孵育时间短、灵敏度高及检测项目多(如肝纤维化、肿瘤标志物、甲状腺、性激素、糖代谢、心肌损伤标志物、贫血、骨代谢及传染病等121个项目)的特点。但不同实验室之间因条件的差异，如工作人员操作习惯、水质、温度、湿度及电压稳定性等诸多因素存在差异性，因此，每个实验室都有必要按各自的系统建立和验证方法学参数，评价MAGLUMI化学发光分析仪各项性能是否符合要求，检测结果是否准确可靠[19]。

精密度是定量测定中最基本的性能指标。本研究结果显示，MAGLUMI 4000化学发光分析仪测定HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ批内精密度分别为3.01%、3.9%、3.70%和1.81%，均小于厂商说明书给定的允许范围(＜5%)，表明该仪器在本室的检测环境中系统重复性符合要求，精密度良好，能满足临床检验质量标准。

准确度是通过定值质控品或校准品的测定并计算其偏倚(%)，若测定结果在厂商规定的限值之内，准确度可被确认。按照NCCLS EP15-A[20]文件和ISO15189文件中对准确度的评价要求，可通过比对定值质控品或校正品来对系统的准确度进行验证。本研究结果显示，MAGLUMI 4000化学发光免疫分析仪检测HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的校正品结果与靶值的相对偏倚分别为0.09%、-4.4%、0.2%和-5.3%，均在允许范围之内，表明其检测HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ准确度性能符合厂商及实验室要求。

4　结语

在确保使用原装配套试剂的前提下，本研究验证的HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ线性范围与厂商提供的线性范围相近，均在厂商提供线性范围之内。按照NCCLSC28-A2[13]文件要求，本研究对HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ的正常参考范围进行了验证，结果显示，MAGLUMI 4000化学发光分析仪测定本区健康人群血清中HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ的含量均与厂商推荐的参考区间相符合，可直接引用厂商的参考范围。新产业MAGLUMI化学发光分析仪检测肝纤维化指标HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的方法性能良好，可满足要求，能够为临床诊断提供准确可靠的结果。

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Research on performance verification methodology for testing hepatic fibrosis indicators by Snibe MAGLUMI chemiluminescence immunoassay analyzer

HUANG Yong-pan, WEI Rong-guo, QIN Zheng, et al// China Medical Equipment,2016,13(11):43-46.

Objective: To detect hepatic fibrosis parameter methodology performance for validation of Snibe MAGLUMI automatic chemiluminescence immunoassay analyzer. Methods: Recommended by the American association of clinical laboratory standardization (CLSI) method, we detected the determination of hyaluronic acid (HA), Laminin (LN), Ⅲ procollagen N-terminal peptide (PⅢ PN-P), Ⅳcollagen (C Ⅳ), and the precision, accuracy, linear range, sensitivity and biological reference range by MAGLUMI analyzer. Results: MAGLUMI determination of HA, LN, PⅢ PN-P, C Ⅳ and precision, and the daytime in this batch variation coefficient were 3.01～4.82% and 3.77～4.69%. Relative bias must lean between -5.3% and 0.2%. The scope of determination of linear range and the manufacturer were similar. The value of HA, LN, PⅢ PN-P, C Ⅳ and reference interval coincidence rate provided by manufacturers were all 100%. And the sensitivities were 1.30ng/ml, 0.9ng/ml, 0.49ng/ml and 0.54ng/ml. Conclusion: MAGLUMI can be used in quantitative analysis of the content of HA, LN, PⅢ PN-P and C Ⅳ directly, which are indicators of liver fibrosis in human serum. Precision, accuracy, linear range, sensitivity and biological reference range show good performance in this methodology. The results of report are accurate and reliable. MAGLUMI is an ideal way to determine the degree of liver fibrosis.

Chemiluminescence immunoassay analyzer; Hepatic fibrosis indicators; Performance evaluation

黄永攀,男,(1976- ),大专，主管技师。南宁市第一人民医院埌东医院检验科，从事临床检验工作。

1672-8270(2016)11-0043-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.013

①南宁市第一人民医院埌东医院检验科 广西 南宁 530000

②南宁市第一人民医院检验科 广西 南宁 530000

③南宁市第一人民医院核医学科 广西 南宁 530000

2016-05-10