头穴透刺对脑梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA、Ca2+影响研究

桑鹏 王顺 赵佳辉

头穴透刺对脑梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA、Ca2+影响研究

桑鹏 王顺 赵佳辉

目的 观察头穴透刺对脑梗死大鼠NO、PKA、PDGFR-β、Ca2+的影响。方法 运用线栓方法制作脑梗死的大鼠模型，对模型大鼠行头穴透刺及一般针刺，药物治疗；14 d后检测大鼠PDGFR-β、PKA及NO、Ca2+的变化。结果 头穴透刺明显提升大鼠PDGFR-β、PKA的表达；降低NO含量、升高Ca2+离子含量。头穴透刺组的治疗效果优于其他两组。结论 与其他两组比较，头穴透刺明显提升大鼠PDGFR-β、PKA的表达；降低NO含量、升高Ca2+离子含量，对脑保护作用效果显著。

脑梗死；头穴透刺；NO；PKA；PDGFR-β；Ca2+

脑梗死的发病率、患病率和死亡率随年龄增加而增加，给患者的家庭、社会带来沉重的负担。针刺治疗脑梗死在临床上疗效显著，但很少有作用机制研究。为提高患者临床疗效，进一步阐明针灸治疗脑梗死机制，本研究采用不同治疗针灸方法脑梗死病例。同时进行实验研究观察脑梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA及Ca2+的变化，为针灸治疗脑梗死患者提供理论及实验依据。

1 模型

1.1 实验方法

150只大鼠参照随机对照表分为头穴透刺组，一般针刺组，药物注射组。

1.2 模型复制

线栓法复制大鼠大脑中动脉梗死的模型[1]。大鼠腹腔麻醉，分离出大鼠的颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，动脉夹暂时夹闭CCA和ICA，鱼线经颈内动脉与颈外动脉分叉的膨大处切口插入颈内动脉，鱼线插入完成后和颈内动脉一起结扎，取下动脉夹。缝合完成2小时后将鱼线拔出，鱼线球端退至颈总动脉，实现再灌注。

1.3 模型成功标志

造模成功后大鼠同侧的Horner征和大鼠对侧前肢为重的偏瘫。

1.4 模型评估

大鼠清醒后对大鼠的神经行为学表现进行评分，0分：未能发现大鼠神经损伤的症状；1分：大鼠对侧前爪完全伸直受限；2分：大鼠只能向对侧转圈；3分：大鼠会向对侧倾倒；4分：大鼠意识丧失及无法自主活动。

2 方法

头穴透刺组：选穴：百会透双侧曲鬓，前神聪透向双侧悬厘；患侧上肢的曲池、手三里、外关、合谷及患侧下肢阳陵泉、丰隆、足三里、三阴交。得气后上述穴位选用G-6805型电针仪给予适当刺激。每日刺激1次，7 d为1疗程，共治疗2个疗程。

一般针刺组：选穴：患侧上肢的曲池、手三里、外关、合谷及患侧下肢阳陵泉、丰隆、足三里、三阴交；得气后上述穴位选用G-6805型电针仪给予适当刺激。每日刺激1次，7 d为1疗程，共治疗2个疗程。上述电针仪均为青岛鑫升实业有限公司准字2000第2270088号电针仪。

药物注射组：脑蛋白水解物注射液（曲奥）30 ml（三联药业有限公司，国药H20051202），每日注射1次，7 d为1疗程，共治疗2个疗程。

3 指标检测

3.1 PDGFR-β的检测

本实验使用的染色试剂是辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素。基本步骤：组织进行石蜡切片，将切好并用福尔马林固定的组织切片在常温中静置1 h，进行脱蜡致水化，再用蒸馏水冲洗；3%甲醇—过氧化氢室温孵育8 min左右，用来减少过氧化物酶的活性，pH 7.2左右的PBS缓冲剂清洗6 min；使用微波抗原修复，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物在37℃孵育10 min，PBS洗4 min；DAB显色液显色，用自来水冲洗来终止反应；苏木精再复染，脱水，透明，封片。用PBS来代替一抗作为阴性对照组。

3.2 PKA蛋白活性表达（westernblot法）

组织中蛋白的提取步骤：第一步SDS-PAGE电泳。第二步电转印，从电传印正极通过滤纸、NC膜到达电传印负极。第三步去离子水多次清洗NC膜后浸入丽春红S染色液，铅笔标出蛋白质Marker位置，多次浸泡至NC膜颜色褪去。第四步加入封闭液室温下2 h。每间隔10 min清洗1次NC膜，反复3次清洗；继续室温下静置2 h。再每间隔10 min清洗1次NC膜，反复3次清洗，

加入无磷酸盐封闭液，用去离子水洗涤终止反应。

3.3 NO、Ca2+的检测

依照次序对加入100 μl的标准品于空白微孔；标准品孔中和样品孔中加入50μl的酶标记溶液，液体充分混匀，保险膜密封酶标板，37℃的水浴锅中水浴60 min；加入底物A 50μl，移液器反复吸打混匀。微孔中加入50 μl的终止液，移液器混匀，在TECAMGENIOS酶标仪上，450 nm处测定OD，根据制备的标准曲线，计算样本含量。

4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，组间、组内比较均用q检验。

5 结果

5.1 三组治疗前后PKA含量变化分析

治疗后，头穴透刺组、药物治疗组、一般针刺组PKA含量均增加，与治疗前比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；治疗2个疗程后，头穴透刺组PKA含量高于一般针刺组与药物注射治疗组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

5.2 三组PDGFR-β阳性细胞计数分析

治疗2个疗程后，头穴透刺组PDGFR-β阳性细胞计数均高于药物治疗组、一般针刺组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。加表2。

5.3 三组NO含量变化分析

头穴透刺组NO含量变化治疗前后比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；药物治疗组、一般针刺组NO含量变化治疗前后比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；治疗14 d后，头穴透刺组与一般针刺组，药物注射治疗组对比，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。加表3。

5.4 三组血浆Ca2+含量变化分析

头穴透刺组Ca2+含量变化治疗前后比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；药物治疗组、一般针刺组Ca2+含量变化治疗前后比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；治疗14 d后，头穴透刺组与一般针刺组，药物注射治疗组对比，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。加表4。

表1 三组PKA含量变化（±s）

表1 三组PKA含量变化（±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.01；药物治疗组、一般针刺组治疗后与治疗前比较，▲P＜0.05；治疗2个疗程后，与药物治疗组、一般针刺组对比，#P＜0.01

组别 治疗前（mmol/L） 1疗程后（mmol/L） 2疗程后（mmol/L）头穴透刺组 51.66±0.21 82.77±0.19△# 103.48±1.36△#药物治疗组 51.97±0.30 62.28±0.18▲ 73.34±0.34▲一般针刺组 51.85±0.19 72.25±0.21▲ 90.30±2.27▲

表2 三组PDGFR-β阳性细胞计数（±s）

表2 三组PDGFR-β阳性细胞计数（±s）

注：治疗2个疗程后，与药物治疗组、一般针刺组对比，#P＜0.01

组别PDGF-β阳性细胞头穴透刺组 7.54±2.51#药物治疗组 5.32±1.34一般针刺组 6.34±1.87

表3 三组NO含量变化（±s）

表3 三组NO含量变化（±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.01；药物治疗组、一般针刺组治疗后与治疗前比较，▲P＜0.05；治疗14 d后，与药物治疗组、一般针刺组对比，#P＜0.01

组别 治疗前（μmol/L） 治疗后7 d（μmol/L） 治疗后14 d（μmol/L）头穴透刺组 82.99±14.61 48.13±10.32△# 32.47±10.05△#药物治疗组 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲一般针刺组 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲

表4 三组血浆Ca2+含量变化（±s）

表4 三组血浆Ca2+含量变化（±s）

注：与治疗前比较，△P＜0.01；药物治疗组、一般针刺组治疗后与治疗前比较，▲P＜0.05；治疗14 d后，与药物治疗组、一般针刺组对比，#P＜0.01

组别 治疗前（mmol/L） 治疗后7 d（mmol/L） 治疗后14 d（mmol/L）头穴透刺组 1.86±0.11 2.77±0.19△# 2.98±0.27△#药物治疗组 1.87±0.20 2.28±0.18▲ 2.38±0.23▲一般针刺组 1.88±0.12 2.25±0.21▲ 2.51±0.18▲

6 讨论

PDGF促进邻近的细胞生长，结合受体后作用于细胞介质，对胶质细胞和间质细胞具有促有丝分裂和趋化的作用[1]，PDGF最初从血小板中发现，参与血管内膜的重建，加速组织创伤修复。提高GABA能神经元及胶质细胞的有效利用率。论证了头穴透刺对脑梗死后神经恢复的功能，PDGFR-β表达和PDGF的功能密切相关[2]。

NO维持血管张力从而舒张血管，对血压的高低、血流分布、抑制血小板聚集、预防动脉粥样硬化及改善代谢有重要的意义，是活跃的血液调节因子[3]。头部透穴组NO含量明显降低，说明头部透穴可减少NO含量，增加脑部血管灌注，有利于脑神经的修复。

PKA的作用底物有离子通道、结构和调节蛋白等转录因子[4]，

含有不同种亚型。兴奋时突触前神经末梢释放递质，突触后膜上的相应受体得到激活，释放cAMP激活PKA，从而膜对离子的通透性得到改变[5]，PKA进入核内更便利。头穴透刺治疗后，神经细胞内Ca2+浓度升高，cAMP浓度上升，激活PKA-CREB提高神经再生的功效[6]。

2个疗程后，头针透穴组的模型大鼠Ca2+浓度升高，论证了降低NO为代表的氧自由基水平可以保护脑神经[7]。PKA受体损伤和钙离子含量的升高受阻，降低了神经损害，增加神经相关功能的恢复[8]。该试验采用分三组进行对比试验，结果证实：三组治疗对脑梗死均有疗效，头针透穴组治疗效果优于其他两组，提供头穴透刺对脑梗死患者的治疗疗效实验室数据。

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The Effect of Scalp Acupuncture on PDGFR-β, NO, PKA, Ca2+in Rats With Cerebral Infarction

SANG Peng WANG Shun ZHAO Jiahui Department of Acupuncture, Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150001, China

Objective The Effect of scalp penetration acupuncture on NO, PKA, PDGFR-β, Ca2+in rats with cerebral infarction. Methods Using suture-occluded method in the rats medels With cerebral infarction. Scalp penetration acupuncture, general acupuncture and medication in rats. Detecting the change of PDGFR-β, PKA, NO, Ca2+in rats after two of treatment courses. Results Scalp penetration acupuncture significantly improve PDGFR-β, PKA expression and increase Ca2+ion content. At the same time reduce NO content. The therapeutic effect of scalp penetration acupuncture group is better than the other two groups. Conclusion Scalp penetration acupuncture group Compared with the other two groups has the best effect on brain protection

Cerebral infarction, Scalp acupuncture, NO, PKA, PDGF-β, Ca2+

R246.6

A

1674-9308（2016）32-0221-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.32.125

黑龙江省中青年攻关项目 ZQG009

黑龙江省中医药科学院针灸科，黑龙江 哈尔滨 150001