斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

刘礼辉，张德锋，李宁求，付小哲，林 强，石存斌

(中国水产科学研究院 珠江水产研究所，农业部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)



斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

刘礼辉，张德锋，李宁求，付小哲，林 强，石存斌

(中国水产科学研究院 珠江水产研究所，农业部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)

【目的】 建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】 根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列，设计3对特异性引物，优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法，对其特异性和灵敏度进行考察，并将其用于临床样品的检测。【结果】 建立的多重PCR方法，当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0，1.0和0.5 μmol/L，退火温度为59.5 ℃时，各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明，建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、 维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091，262和450 bp的目的片段，从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段，而对其他对照组的扩增结果均为阴性；敏感性试验结果表明，建立的多重PCR最低可分别检测出200 CFU/mL的嗜水气单胞菌、300 CFU/mL的维氏气单胞菌和200 CFU/mL的鮰爱德华菌；对临床样本的检出率为100%，与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】 建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速，可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌，也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。

斑点叉尾鮰；败血症；嗜水气单胞菌；维氏气单胞菌；鮰爱德华菌；多重PCR

斑点叉尾鮰(IctaluruspunctatusRafinesque)属鲶形目(Silurformes)、鮰科(Ictaluridae)、叉尾鮰属(Ictalurus)，是美国主要的水产养殖品种之一。自1984 年斑点叉尾鮰被引进我国后，经过30 多年的推广，现在已经在30 个省(区、市)开展了该鱼的养殖[1]。随着我国斑点叉尾鮰集约化养殖的迅速发展，其病害问题日益突出，严重制约斑点叉尾鮰的健康养殖，其中最主要的细菌病有肠道败血症和出血性败血症等，表现为肛门红肿，体表出血，鳍条基部充血，脾和肾肿大等。国内外学者对患病斑点叉尾鮰出血病病原的研究发现，引起斑点叉尾鮰败血症的主要病原菌为鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri，Ei)[2-3]和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)[4-6]，近年来发现维氏气单胞菌(Aeromonasveronii，Av) 也是引起斑点叉尾鮰发生多器官败血症的常见致病菌，有时还会出现多病原混合感染的情况[7-8]。

目前，对斑点叉尾鮰败血症病原的检测主要采用传统的细菌分离方法，而该法费时费力，且操作复杂，敏感性较低。目前有关病原检测的方法有选择性培养基鉴别培养法、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、斑点酶联免疫吸附试验、单克隆抗体技术及PCR检测技术等，但这些方法每次试验通常只能检测一种致病菌。而目前斑点叉尾鮰败血症的常见病原菌为鮰爱德华菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌等，这就可能需要多次检测才能确定致病菌，使得检测时间延长，检测费用增加，并且延误治疗。因此，本研究拟建立一种能同时检测鮰爱德华菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的多重 PCR检测方法，旨在为斑点叉尾鮰败血症病原的快速诊断、疾病防控和流行病学研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 嗜水气单胞菌ATCC19570株、维氏气单胞菌ATCC51106株、鮰爱德华菌ATCC33202株、保科爱德华菌ATCC33379株、溶藻弧菌ATCC19108株、副溶血弧菌ATCC17802株、海豚链球菌ATCC29178株、无乳链球菌ATCC12386株、迟缓爱德华菌ATCC49231株、温和气单胞菌ATCC43979株，均购买自上海晶赛生物工程有限公司；嗜水气单胞菌XS9141、Ci1293、Ci1294和Hm093株，维氏气单胞菌IB340、Ci12910、Ci12912 和Ci12914株，鮰爱德华菌HSN-1株,舒氏气单胞菌WL-2株[9]，柱状黄杆菌GHS061212株[10]，均为珠江水产研究所水产动物病害与免疫防控实验室分离株。柱状黄杆菌GHS061212的培养条件及培养基配方参照文献[10]，其他菌均采用脑心浸(BHI)液体培养基，28 ℃培养24～48 h。

1.1.2 主要试剂和仪器 2×TaqPCR MasterMix(由TaqDNA Polymerase、2×TaqPCR Buffer、3 mmol/L MgCl2、400 μmol/L dNTP mix以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系)购自康为世纪生物科技(北京)有限公司，DNA Marker DL1000 和DNA Marker DL2000 购自大连宝生物工程有限公司，琼脂糖和细菌 DNA 基因组抽提试剂盒购自OMEGA(中国总代理)广州飞扬生物工程有限公司，多重 PCR 引物由上海生工生物工程有限公司广州分公司合成。主要仪器有高速离心机(Eppendorf 公司，德国)、核酸蛋白检测仪(Eppendorf 公司，德国)、梯度PCR仪 (SENSO，德国)、普通PCR 仪(晶格，中国)、核酸电泳仪(北京六一，中国)和凝胶成像系统VerSa Doc2000(Bio-Rad，美国)。

1.2 方 法

1.2.1 细菌DNA的提取 按OMEGA细菌 DNA 基因组抽提试剂盒的说明提取所有菌株的DNA，用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR引物的设计与合成 根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hemolysin，Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(Deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Hemolysin activator，Eha)序列，通过Primer 5.0软件，经NCBI Blast比对分别设计多对引物，并用阳性DNA进行PCR特异性试验，最后筛选特异性高的3对PCR引物，其序列见表1。

表 1 用于Hly、DNaseⅠ和Eha基因PCR扩增的引物信息

1.2.3 单项PCR引物的特异性验证 对提取的细菌 DNA 模板，采用上述Hly、DNaseⅠ和Eha的引物进行PCR 扩增，检验单项引物的特异性。PCR反应体系：2×PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，模板DNA 0.5 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性50 s，57 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，30 个循环； 最后72 ℃ 10 min。 PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，目的片段用胶回收试剂盒回收，按照载体说明书与pMD18-T Vector 连接， 转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选阳性菌落，提取其质粒，进行质粒PCR 鉴定后，送广州中美泰和生物工程公司测序，并进行序列BLAST比对分析。

1.2.4 多重PCR反应条件的优化 (1)模板质量浓度组合比的优化。测定提取的嗜水气单胞菌ATCC19570株、维氏气单胞菌ATCC51106株、鮰爱德华菌ATCC33202株的DNA质量浓度(ATCC19570株为200 ng/μL，ATCC51106株为555 ng/μL，ATCC33202株为420 ng/μL)后，均稀释为50 ng/μL，按模板不同质量浓度进行组合，组合中嗜水气单胞菌ATCC19570株、维氏气单胞菌ATCC51106株、鮰爱德华菌ATCC33202株的DNA终质量浓度分别为0.5、0.5、0.5 ng/μL,0.5、1、0.5 ng/μL，0.5、0.5、1 ng/μL，0.5、1、1 ng/μL，1、0.5、0.5 ng/μL，1、1、0.5 ng/μL，1、0.5、1 ng/μL，1、1、1 ng/μL。PCR反应体系为50 μL：2×PCR MasterMix 25 μL，3个基因的上、下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，再用双蒸水补齐至50 μL。以单项PCR反应中的扩增程序来确定最佳模板质量浓度。

(2)引物浓度组合比的优化。以取得的最佳模板质量浓度比混匀作为模板，对各引物对的终浓度进行组合，组合中Hly、DNaseⅠ和Eha的引物对终浓度分别为0.5、0.5、0.5 μmol/L，0.5、0.5、1 μmol/L，0.5、1、0.5 μmol/L，0.5、1、1 μmol/L，1、0.5、0.5 μmol/L，1、0.5、1 μmol/L，1、1、0.5 μmol/L，1、1、1 μmol/L)，PCR反应体系中另含2×PCR MasterMix 25 μL，最后用双蒸水补齐至50 μL。采用多重PCR反应确定最佳引物浓度。

(3)退火温度的优化。PCR反应采用模板质量浓度和引物浓度优化后的体系进行PCR扩增，其循环参数为：95 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性50 s，分别于48.4，51.5，54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，30 个循环； 最后72 ℃ 10 min。筛选出多重PCR扩增的最佳退火条件。

1.2.5 多重PCR的特异性试验 分别准备样品1(嗜水气单胞菌 ATCC19570株、鮰爱德华菌 ATCC33202株、维氏气单胞菌 ATCC51106株、温和气单胞菌 ATCC43979株、舒氏气单胞菌WL-2株、迟缓爱德华菌 ATCC49231株)、样品2(嗜水气单胞菌 ATCC19570株、维氏气单胞菌 ATCC51106株)、样品3(嗜水气单胞菌 ATCC19570株、鮰爱德华菌 ATCC33202株)、样品4(维氏气单胞菌 ATCC51106株、鮰爱德华菌 ATCC33202株)、样品5(嗜水气单胞菌 ATCC19570株)、样品6(维氏气单胞菌 ATCC51106株)、样品7(鮰爱德华菌 ATCC33202株)和样品8(温和气单胞菌 ATCC43979株、舒氏气单胞菌WL-2株、副溶血弧菌ATCC17802株、溶藻弧菌 ATCC19108株、迟缓爱德华菌 ATCC49231株)，以各样品的基因组DNA为模板，按最佳多重PCR体系及方法进行扩增，检验引物的特异性。

1.2.6 多重PCR的敏感性试验 取28 ℃培养20 h的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌及培养48 h的鮰爱德华菌菌液，参照国标方法(GB/T 4789.2-2003)进行细菌计数，调整3种菌的浓度分别为2×108CFU/mL的嗜水气单胞菌、3×108CFU/mL的维氏气单胞菌、2×108CFU/mL的鮰爱德华菌，再分别对菌液进行102～107的倍比稀释。取上述不同稀释度菌液1 mL离心(10 000g，1 min)后收集菌体，提取基因组DNA制备PCR模板，用优化的反应体系和条件进行多重PCR扩增，以检测多重PCR反应的灵敏度。

1.2.7 多重PCR方法的临床应用 应用建立的多重PCR方法对50份临床病例进行检测，同时对组织病料进行细菌分离鉴定，以验证多重PCR检测方法的实用性。

2 结果与分析

2.1 PCR方法的建立

2.1.1 引物的特异性 提取1.1节中多种细菌的基因组DNA，Hly、DNaseⅠ和Eha基因的单项PCR扩增结果见图1。

M．DL1000 DNA分子质量标准 DL1000 DNA Marker；图A，Ah1～Ah5依次为嗜水气单胞菌 ATCC19570株、XS9141株、Ci1293株、Ci1294株和Hm093株 Figure A,Ah1-Ah5 were A.hydrophila strains Ah strain ATCC19570,XS9141,Ci1293,Ci1294 and Hm093,respectively；图B，Av1～Av5依次为维氏气单胞菌ATCC51106株、IB340株、Ci12910株、Ci12912株和 Ci12914株 Figure B,Av1-Av5 were A.veronii strains ATCC51106,IB340,Ci12910,Ci12912 and Ci12914,respectively；图C，Ei1和 Ei2依次为鮰爱德华菌ATCC33202株和 HSN-1株 Figure C,Ei1-Ei2 were E.ictaluri strains ATCC33202 and HSN-1,respectively；

由图1可见，嗜水气单胞菌ATCC19570、XS9141、Ci1293、Ci1294和Hm093株均扩增出 1 091 bp的片段，维氏气单胞菌ATCC51106、IB340、Ci12910、Ci12912和Ci12914株均扩增出262 bp的片段，鮰爱德华菌ATCC33202和HSN-1株均扩增出450 bp的片段，而其他种类细菌和空白对照均未扩增出相应条带，与预期结果一致，表明供试引物具有较高的特异性。测序结果经BLAST比对分析，结果显示所获得的3个基因Hly、DNaseⅠ和Eha测序结果与GenBank 中登录的嗜水气单胞菌Hly(CP000462.1)、维氏气单胞菌DNaseⅠ(CP002607.1)和鮰爱德华菌Eha(CP001600.2)基因的同源性均为100%。

2.1.2 多重PCR反应条件的优化结果 1)模板质量浓度组合比的优化。对3种菌基因组DNA不同质量浓度组合比进行优化的PCR产物电泳结果(图2)显示，嗜水气单胞菌ATCC19570株、维氏气单胞菌ATCC51106株、鮰爱德华菌ATCC33202株 DNA的质量浓度组合为0.5，0.5，0.5 ng/μL(泳道1)时扩增效率低于其他质量浓度组合。同样体积的DNA中维氏气单胞菌(第3、5和7泳道)的含量较少时，DNaseⅠ基因(262 bp)的特异性条带相对较弱，但也能有效扩增。泳道6中3个基因的特异性条带都均一且亮度较高，为理想扩增结果，所以最佳模板组合为嗜水气单胞菌1 ng/μL、维氏气单胞菌1 ng/μL、鮰爱德华菌0.5 ng/μL。

2)引物浓度组合比的优化。取不同浓度的引物组合进行多重PCR反应，结果(图3)表明，当维氏气单胞菌DNaseⅠ的引物浓度为0.5 μmol/L(泳道1、2、5和6)时，扩增结果显示DNaseⅠ基因(262 bp)的扩增效率较低。当鮰爱德华菌Eha基因的引物浓度为1.0 μmol/L(泳道2、4、6和8)时，嗜水气单胞菌Hly基因(1 091 bp)的扩增效率相对降低。因此，嗜水气单胞菌Hly、维氏气单胞菌DNaseⅠ、鮰爱德华菌Eha进行多重PCR扩增时引物终浓度分别为1.0，1.0和0.5 μmol/L时扩增效果最好。

M．DL2000 DNA Marker；1-8．嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种菌基因组DNA模板质量浓度比分别为0.5，0.5，0.5；0.5，1，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，1，0.5；1，0.5，1；1，1，1 ng/μL DNA concentration of three pathogens

M．DL2000 DNA Marker；1～8．嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种菌基因引物浓度比分别为0.5，0.5，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，0.5；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，0.5，1；1，1，0.5；1，1，1 μmol/L Primers concentration forA.hydrophila,A.veronii and E.ictaluri were 0.5，0.5，0.5；0.5，0.5，1；0.5，1，0.5；0.5，1，1；1，0.5，0.5；1，0.5，1；1，1，0.5；1，1，1 μmol/L,respectively

3)退火温度的优化。选取不同的退火温度(48.4,51.5,54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃)进行多重PCR反应，结果(图4)显示，各温度下3个基因均得到有效扩增，其中在第5泳道(59.5 ℃)和第6泳道(62.1 ℃)3个基因的扩增效率最为均一，为避免退火温度太高引起的假阴性，因此选59.5 ℃为优化后的最佳退火温度。

多重PCR优化结果表明，其最佳反应体系为：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，PHly上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，PDNaseⅠ上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，PEha上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，以2∶2∶1比例混合的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华菌基因组DNA 1 μL，加双蒸水补足至50 μL。最佳反应条件为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环；然后再72 ℃延伸10 min，反应结束。

2.2 多重PCR 的特异性检测

多重PCR扩增测试菌的结果如图5所示。由图5可知，样品1检测出1 091，450和262 bp共3条特异性的扩增条带，样品2检测出1 091和262 bp的 2条特异性条带，样品3检测出1 091和450 bp 的 2条特异性条带，样品4检测出450和262 bp的2条特异性条带，样品5检测出1 091 bp的特异性条带，样品6检测出262 bp的特异性条带，样品7检测出450 bp的特异性条带，样品8检测结果为阴性。可见，建立的检测方法对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌具有特异性。

M．DL2000 DNA Marker；1～8．退火温度分别为48.4，51.5，54.0，56.8，59.5，62.1，64.5和66.0 ℃

M．DL2000 DNA Marker；1～8.样品1～8的 DNA DNA of sample 1-8

2.3 多重PCR的敏感性检测

从图6可以看出，多重PCR方法对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华菌3种病原菌的灵敏度分别为2×102，3×102和2×102CFU/mL。

M．DL1000 DNA Marker;1～6依次为102～107稀释菌液的嗜水气单胞菌(A)、维氏气单胞菌(B)和

2.4 临床样品的多重PCR检测

50份待检样本中，采用多重PCR方法同时检出嗜水气单胞菌和鮰爱德华菌的样品有2份，同时检出嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的样品有1份，单一检出嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌和维氏气单胞菌的样品分别有31份、2份和14份，其检出率为100%。再采用传统生物学检测方法进行验证，符合率达100%。

3 讨 论

斑点叉尾鮰败血症是造成斑点叉尾鮰养殖损失最严重的疾病，该病有急性和慢性死亡2种类型，急性型来势猛，呈暴发性，有明显的死亡高峰期，死亡率较高；慢性型则死亡缓慢，无死亡高峰期，日死亡率低，但死亡可持续1个月左右，导致累计死亡率较大。鮰爱德华菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌引起斑点叉尾鮰败血症在发病症状上都会表现为体表出血(多出现在头部、腹部、体侧或鳍条基部)，感染后症状难以区分，且有时会出现这几种菌复合感染的可能。因此，快速、准确地获知该病的病原是控制该病和减少经济损失最有效的方法[11]。目前，这3种病原菌的鉴定主要通过病原分离及传统生化鉴定等方法，在诊断过程中易引起误诊和漏检。随着分子生物学的发展，PCR检测方法也被广泛用于疾病病原检测领域，如采用PCR技术、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术LAMP及特异噬菌体等多种方法对单一病原鮰爱德华菌[12-15]、致病性嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌进行检测[16-17]。多重PCR方法因其快速、灵敏和特异的特点，及具有一次检测多个病原基因的优势，针对某些难培养或不能培养的细菌检测以及临床混合感染的诊断尤为有效[18]。饶静静等[19]建立了多重PCR方法，对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌的混合感染进行了检测；隗黎丽等[20]建立了鮰爱德华菌和迟钝爱德华菌的二重PCR检测技术；Persson等[21]通过多重PCR技术开展了气单胞菌的快速鉴定方法的研究。由于斑点叉尾鮰败血症病日益严重与复杂，因此需要建立一种快速、准确的检测方法用于该病的诊断和流行病学调查。

本研究检测引物是基于细菌的Hly、DNaseⅠ和Eha基因序列设计的。溶血素(HlyA)是气单胞菌的重要毒力因子，大多数气单胞菌属于条件致病菌，具有致病菌株与非致病菌株之分，HlyA基因能够用于致病菌株的检测[22-24]。脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)是一种细胞外酶，主要用于肠杆菌科细菌种的鉴定[25-26]。爱德华菌溶血相关基因Eha作为毒力调控基因，在迟缓爱德华菌中研究较多，在鮰爱德华菌中研究较少。本研究根据Hly、DNaseⅠ和Eha这3个基因合成了3对特异性引物，从混合3种菌的菌液中提取了细菌DNA，运用多重PCR技术成功扩增出了长度分别为1 091，262和450 bp的特异性片段。在建立多重PCR检测方法时，由于各模板质量浓度、各引物间的比例和退火温度等因素对试验结果的影响较大，因此有必要对多重PCR的反应条件进行优化。试验结果表明，3种菌的模板质量浓度对扩增结果影响不大，均能有效扩增出特异性条带。3对特异性引物间的比例对多重PCR扩增效率有一定的影响，由于维氏气单胞菌DNaseⅠ基因的扩增片段较小，当DNaseⅠ基因的引物含量较低时，容易出现假阴性的结果，因此反应体系中应适量增加DNaseⅠ基因的引物含量；鮰爱德华菌Eha基因的引物浓度太高时会影响嗜水气单胞菌Hly基因的扩增，因此，反应体系中引物终浓度以Hly上下游引物各1.0 μmol/L、DNaseⅠ上下游引物各1.0 μmol/L、Eha上下游引物各0.5 μmol/L时扩增效果最好。本研究中退火温度对多重PCR试验结果的影响不大，在48～66 ℃均能扩增出特异条带，其中59.5和62.1 ℃的扩增效果最好，为了避免由于退火温度高导致的漏检，因此选用59.5 ℃作为多重PCR方法的最佳退火温度。特异性试验结果表明，优化的多重PCR方法对斑点叉尾鮰及水产动物中常见的病毒检测结果均为阴性，显示了良好的特异性。传统的酶联免疫吸附法(ELISA)对鮰爱德华菌的最低检测限为106CFU/mL，且全过程需要4～7 d，而本研究建立的多重PCR方法对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、鮰爱德华菌3种病原菌的灵敏度分别为2×102，3×102和2×102CFU/mL，且可以直接从组织中提取细菌基因组进行PCR扩增与电泳，整个过程只需3～5 h，说明本研究建立的多重PCR方法比传统细菌分离鉴定方法更敏感、快速且简便。

将本研究建立的多重PCR方法应用于临床上，检测50份样品中嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌和维氏气单胞菌的感染情况，结果共检出3例混合感染的阳性样品以及47份单一感染的样品，用传统生物学检测方法经多次分离后的检测结果与单项PCR方法检测结果一致，表明该方法能够准确鉴定这几种菌引起的败血症病，可以满足临床检测的需要，能够用于斑点叉尾鮰败血症病的流行病学调查中。在PCR扩增时，组织总DNA、菌落及菌液等均可作为反应模板，不仅大大缩短了检测时间，简化了操作过程，而且降低了检测成本，同时也降低了采样和病料保存要求；将组织总DNA用作检测模板，使得该PCR诊断方法可以将病料集中处理及诊断，增强了不同地区鱼病流行病学调查的准确性和可靠性。

4 结 论

建立的多重PCR检测方法快速、特异、灵敏，可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症病的3种病原嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌，也可以用于其他水生动物中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。

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Establishment of multiplex PCR to detect three pathogens of “septicaemia” from channel catfish,Ictaluruspunctatus

LIU Lihui,ZHANG Defeng,LI Ningqiu,FU Xiaozhe,LIN Qiang,SHI Cunbin

(PearlRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofAquaticAnimalImmuneTechnology,Guangzhou，Guangdong510380,China)

【Objective】 This study established a multiplex PCR method to rapidly detect three pathogens (Aeromonashydrophila,AeromonasveroniiandEdwardsiellaictaluri) of “septicaemia” from channel catfish,Ictaluruspunctatus.【Method】 Three pairs of primers were designed based on the conservative sequences of hemolytic toxin genes (Hly) ofA.hydrophila,deoxyribonucleaseⅠgenes (DNaseⅠ) ofA.veroniiand haemolysin activator genes (Eha) ofE.ictaluri.Then multiplex PCR condition was optimized and the multiplex PCR for simultaneously detectingA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluriwas established.The specificity and sensitivity were detected and it was applied to clinical samples detection.【Result】 All target fragments were amplified when the concentrations ofHlygene,DNaseⅠgene andEhagene were 1.0,1.0 and 0.5 μmol/L and the annealing temperature was 59.5 ℃.The specificity test showed that fragments of 1 091, 262 and 450 bp were amplified from the genomic DNA ofA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluri,respectively.Three fragments were amplified from mixed DNA sample ofA.hydrophila,A.veronii,E.ictaluriand other bacteria simultaneously,while no amplification was achieved from other negative control groups.The sensitivity test showed that the multiplex PCR had a high sensitivity with the detection limit of 200 CFU/mL forA.hydrophila,300 CFU/mL forA.veroniiand 200 CFU/mL forE.ictaluri.The coincidence rate of the multiplex PCR method and traditional biology detection method for suspicious clinical samples was 100%.【Conclusion】 The established multiplex PCR method was specific,sensitive and rapid to respectively or simultaneously detect the three pathogens ofA.hydrophila,A.veroniiandE.ictaluriof “septicaemia” from channel catfish,I.punctatusor other aquatic animals.

channel catfish;septicaemia;Aeromonashydrophila;Aeromonasveronii;Edwardsiellaictaluri;multiplex PCR

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.006

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.012.html

2015-04-02

国家科技支撑计划项目(2012BAD25B02)；现代农业产业技术体系建设专项(CARS-46)

刘礼辉(1982-)，女，湖南娄底人，助理研究员，硕士，主要从事水产养殖病害研究。 E-mail:lhliu0614@163.com

石存斌(1964-)，男，湖南永州人，研究员，主要从事水产养殖病害研究，E-mail:shicunbin2006@163.com

S941.41+3

A

1671-9387(2016)11-0039-08