青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

周 勇，范玉顶，黄莉莉，曾宪辉，张雪萍，张琳琳，曾令兵

(1 中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉430223；2 湖州师范学院 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，浙江 湖州 313000；3 华中农业大学 水产学院，湖北 武汉4300701；4 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)



青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

周 勇1,2,3，范玉顶1，黄莉莉4，曾宪辉4，张雪萍3，张琳琳3，曾令兵1

(1 中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉430223；2 湖州师范学院 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，浙江 湖州 313000；3 华中农业大学 水产学院，湖北 武汉4300701；4 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

【目的】 开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】 采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodonpiceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列，然后根据其末端序列设计特异性引物，扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列，对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析，同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体，将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】 青鱼IFN-γcDNA全长为895 bp，其开放阅读框大小为549 bp，编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示，青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%～7.7%，与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高，为16.3%～92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似，包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现，IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调，最高的为头肾，其次为脾、皮肤、鳃和肾，而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】 成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA，经Poly I:C诱导后，该基因在头肾中上调倍数最为显著，青鱼γ-干扰素在体外获得表达。

青鱼；IFN-γ基因；结构特征；表达分析

干扰素(IFN)是一类能够诱导脊椎动物细胞产生抗病毒蛋白的分泌型细胞因子，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3种[1]。其中，Ⅱ型干扰素即γ-干扰素(INF-γ)，主要由NK细胞产生，也可由单核吞噬细胞及抗原提呈细胞分泌的IL-12和IL-18刺激T淋巴细胞产生[2-4]。IFN-γ能诱导巨噬细胞产生毒性物质或促使宿主细胞合成大量抗病毒蛋白，还可介导白细胞聚集、调节T细胞增殖和分化、增强抗原提呈，从而使机体呈现抗病毒状态[4]。

IFN-γ基因已在斑马鱼[5]、鲤鱼[6]、虹鳟[7]、斑点叉尾鮰[8]、大西洋鲑[9]、金鱼[10]、斜带石斑鱼[11]、河豚鱼[12]等多种鱼类中克隆得到。鱼类与哺乳动物的IFN-γ基因同源性较低，但其在调节免疫应答和抗病毒等方面的作用与哺乳动物一致[13]。作为一种高效的非特异性免疫因子，INF-γ在鱼类的抗病毒感染免疫中发挥重要作用[6-12]。青鱼(Mylopharyngodonpiceus)属于鲤科鱼类，主要分布于我国长江以南的平原地区，是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一。但是，随着养殖范围、规模、密度的不断扩大，青鱼病害问题频繁发生，制约了青鱼养殖产业的健康发展。迄今为止，尚未见有关青鱼IFN-γ编码序列、结构特征和表达谱分析等的研究报道。因此，开展青鱼抗病相关基因及蛋白质分子结构特征与表达谱研究，对于青鱼健康养殖具有重要的理论意义和应用价值。本研究进行了青鱼IFN-γ基因的克隆、结构特征与表达谱分析，旨在为进一步研究青鱼IFN-γ在抗病毒感染防御中的功能与调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验鱼与细胞系 青鱼质量约100克/尾，购自武汉某养殖场，暂养在实验室 100 cm×50 cm×60 cm水族箱中， 1 周后用于试验。青鱼鳍条组织细胞系(BC-Fin)置于含体积分数15%胎牛血清的L-15培养液中，25 ℃下培养，由长江流域水生动物疫病重点实验室建立并保存。

1.1.2 试 剂 反转录试剂盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit和SMARTer RACE cDNA Amplification kit为Clontech公司产品；Dnase Ⅰ、测序载体pMD19-T、大肠杆菌菌株DH5α以及用于PCR扩增的TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、DNA Marker为TaKaRa公司产品；真核表达质粒pcDNA3.1(+)为 Life Technologies公司产品；各种限制性内切酶和DNA连接酶为Promega公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒DNA小量提取试剂盒为OMEGA Bio-Tek公司产品；脂质体Lipofectamine 2000 为Invitrogen公司产品；鼠抗His标签抗体为Abcam公司产品；免疫荧光染色试剂盒(抗鼠Cy3)为碧云天公司产品。

1.2 总RNA提取及青鱼IFN-γ基因cDNA的扩增

无菌条件下取青鱼肾脏组织10 g，利用Trizol法提取总RNA。将提取的总RNA用Dnase Ⅰ于37 ℃下处理30 min后回收产物，按照反转录试剂盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit说明书，反转录扩增获得青鱼IFN-γ基因cDNA 第一链。

1.3 青鱼IFN-γ基因的克隆

根据已知硬骨鱼类IFN-γ序列设计简并引物(表1)，扩增得到青鱼IFN-γ基因部分片段，反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，引物JB1-F和JB1-R(10 mmol/L)各1 μL，ddH2O 14.8 μL。再按SMARTer RACE cDNA Amplification kit要求，分别设计正、反向第一次扩增，反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，运行5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，运行5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，运行27个循环；72 ℃ 10 min。将外引物(NUP,RACE1-3F/RACE1-5R)PCR产物用无菌水稀释50倍后，取1 μL稀释液作为内引物(NUP,RACE2-3F/RACE2-5R)PCR反应的模板，进行第二次PCR扩增，反应体系为：10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL， 50×二聚合酶混合物1 μL，NUP(10 mmol/L)1 μL，引物RACE2-3F和RACE2-5R(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 40 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，运行35个循环；72 ℃ 10 min。根据巢式PCR所得到的IFN-γ3′和5′端基因序列设计引物，扩增青鱼IFN-γcDNA。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)电泳检测，回收产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表 1 本试验所用引物序列

1.4 青鱼IFN-γ基因序列分析

利用NCBI的BLAST软件对青鱼IFN-γ基因及氨基酸序列进行同源性比较；用SignalP和PSIRED软件对其编码蛋白进行信号肽预测及二级结构分析；用Clustal W和MEGA软件对氨基酸序列进行多重比对及系统进化分析。

1.5 青鱼IFN-γ基因的表达谱分析

取试验鱼20尾，平均分为试验组和对照组，试验组每尾鱼腹腔注射500 μL(2.5 mg)Poly I:C，对照组每尾鱼腹腔注射DPBS 500 μL。24 h后分别取试验组和对照组青鱼的脑、鳃、心、头肾、肾、脾和皮肤组织，提取各组织总RNA，反转录扩增为cDNA。根据青鱼IFN-γ基因序列合成荧光定量PCR引物JC-F和JC-R(表1)，以β-actin作为内参基因。将目的基因扩增产物经胶回收纯化后于16 ℃与pMD19-T载体连接1 h，用连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞并扩增培养后提取质粒，用分光光度计测定质粒浓度，计算重组质粒的DNA拷贝数。质粒经10倍梯度稀释后，作为标准模板进行荧光定量PCR扩增，制作标准曲线。在荧光定量PCR仪(Rotor-Gene 6000,Qiagen)上进行扩增，反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环，反应结束后绘制标准曲线。根据各组织样品的Ct值计算IFN-γ和β-actin 基因的拷贝数，并以β-actin基因拷贝数为准对目的基因拷贝数进行归一化处理。

1.6 青鱼IFN-γ真核表达载体的构建

利用引物M.IFNγ-F/M.IFNγ-R(表1)扩增带有EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位点的青鱼IFN-γ开放阅读框，设计引物时在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，除去IFN-γ终止密码，并在3′末端加上6×His标签进行融合表达。双酶切后将目的片段连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，PCR筛选阳性克隆，扩大培养后提取质粒，经酶切鉴定后，命名为pcDNA3.1(+)-IFN-γ，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.7 pcDNA3.1(+)-IFN-γ在青鱼鳍条细胞中的表达分析

通过脂质体Lipofectamine 2000将真核表达载体pcDNA3.1(+)-IFN-γ转染到青鱼鳍条细胞(BC-Fin)中，同时设置空质粒对照。将转染后的细胞置于25 ℃恒温箱培养，于转染后24，48，72，96和120 h分别取出一瓶细胞，用His抗体(Abcam)作为一抗，红色荧光探针标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体为二抗，参照免疫荧光染色试剂盒说明对转染后的细胞进行间接荧光免疫检测。

2 结果与分析

2.1 青鱼IFN-γ基因结构特征

青鱼IFN-γ基因cDNA(GenBank 登录号：KP257568)全长为895 bp(图 1)，其开放阅读框大小为549 bp，编码一个含有182个氨基酸的蛋白，其5′和3′端分别有138，208 bp的非编码区。

2.2 青鱼IFN-γ氨基酸序列结构特征及比对分析

将青鱼IFN-γ与部分高等脊椎动物和鱼类的IFN-γ氨基酸序列进行相似性比对，结果(表2)显示，青鱼IFN-γ与高等脊椎动物IFN-γ氨基酸序列相似性仅为1.5%～7.7%，而与鱼类IFN-γ的相似性为16.3%～92.9%，其中与草鱼(C.idella)IFN-γ的相似性最高，为92.9%。

下划线标示起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)

表 2 青鱼与12个其他物种IFN-γ氨基酸序列的同源性(右上角)和差异性(左下角)

注：1～13分别为青鱼、金鱼、鲤鱼、草鱼、斑马鱼、斑点叉尾鮰、鸡、人、露斯塔野鲮、虹鳟、黑青斑河鲀、鼠、红鳍东方鲀的IFN-γ氨基酸序列。

Note:1-13 are IFN-γ amino acid sequences ofMylopharyngodonpiceus(KP257568),Carassiusauratus(ACG68885.1),Cyprinuscarpio(1 CAJ51088.1),Ctenopharyngodonidella(2 JX196701.1),Daniorerio(NP_998029.1),Ictaluruspunctatus(1 NP_001187231.1),chicken (NP_990480.1),human (AAX42631.1),Labeorohita(HQ667144.1),Oncorhynchusmykiss(NP_001153975.1),Tetraodonnigroviridis(CAF95605.1),mouse (NP_03063.1),Takifugurubripes(CAE82301.2).

青鱼IFN-γ蛋白二级结构包含7个α螺旋结构，N端存在1个信号肽序列(MTAQHMMAIFWGVCLLILRRMTYA)，而C末端存在IFN-γ家族的特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)(图2)。利用MEGA软件构建的硬骨鱼类IFN-γ蛋白序列进化系统发育树表明，青鱼IFN-γ与草鱼(C.idella)IFN-γ聚为一支(图3)。

相似的氨基酸用“.”和“:”表示，信号肽序列用下划线表示，保守的α-螺旋结构以序列上方加黑线表示，IFN-γ特征序列以阴影表示，核定位序列用黑框表示

2.3 青鱼IFN-γ基因的组织表达谱

青鱼注射Poly I:C后，采用荧光定量PCR法检测IFN-γ的表达谱，结果见图4。如图4所示，Poly I:C能诱导青鱼头肾、脾、皮肤、鳃和肾组织中的IFN-γ表达显著上调，IFN-γ表达量分别为对照组的25，22，18，13和9倍，且以头肾中的上调变化最为显著，而心脏和脑组织中无显著变化。

图 3 硬骨鱼类IFN-γ蛋白序列系统发育树分析

*表示与对照组差异显著(P<0.05)

2.4IFN-γ在青鱼鳍条组织细胞中的表达

将真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ转染青鱼鳍条细胞，在24，48，72，96和120 h分别取出一瓶细胞，利用His抗体作为一抗，进行间接荧光免疫检测。结果(图5)表明，转染重组质粒的青鱼鳍条细胞24 h后在绿光激发下有鲜艳的红色出现，并且随着细胞培养时间的延长，红色荧光数量增多，72 h红色荧光数量最多；而转染空质粒的青鱼鳍条细胞则没有红色荧光出现。

3 讨 论

本研究从青鱼肾脏组织中克隆得到了IFN-γ基因cDNA全长序列，该基因编码的氨基酸序列与草鱼、鲤鱼和鲫鱼的IFN-γ氨基酸序列有很高的相似性，这是由于它们均属于鲤科鱼类，有较近的亲缘关系。青鱼IFN-γ蛋白二级结构包含7个α螺旋结构，该结构中全部肽键都可以形成氢键，故有助于其结构的稳定[14]。此外，青鱼IFN-γ N端的信号肽可指导其跨膜转移、C末端存在的核定位基序有助于IFN-γ进入细胞核，最终使得信号转导过程顺利完成[7,15]。青鱼及其他硬骨鱼类的IFN-γ中都包含这段基序，推测这段基序对于硬骨鱼类IFN-γ的功能是至关重要的。

对哺乳动物的研究表明，经抗原刺激后可致巨噬细胞、NK细胞、Th1细胞以及与抗原提呈相关的细胞产生IFN-γ[16-18]。硬骨鱼类的巨噬细胞和淋巴细胞主要存在于头肾和脾脏中。斑马鱼、虹鳟、大西洋鳕鱼经Poly I:C诱导后，其免疫器官中IFN-γ的表达水平都会显著升高，尤其头肾组织中IFN-γ的表达水平上调最明显[7,12-13]。而斑点叉尾鮰在受到外来抗原物质刺激后，其外周血淋巴细胞中的IFN-γ转录水平显著上调[19]。本研究中青鱼腹腔注射Poly I:C后，头肾、脾脏等鱼类主要免疫器官中IFN-γ的表达量显著上调，表明脊椎动物IFN-γ的细胞来源及功能在进化历程中有较高的保守性。

A.白光下的青鱼鳍条细胞；B，C，D，F，G，H.荧光显微镜下pcDNA3.1(+)-IFN-γ转染24，48，48，72，96和120 h后的细胞；E.荧光显微镜下空质粒转染后的细胞。标尺 100 μm

为方便体外开展青鱼IFN-γ功能研究，本研究选择使用真核表达系统在青鱼鳍条细胞系中表达IFN-γ。设计引物时，在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，同时在终止密码子(TAG)前加上6×His基因(CATCATCATCATCATCAT)，以增强基因的融合表达，便于对蛋白表达情况进行检测。将重组质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ转染青鱼鳍条细胞后，用表达的融合蛋白与鼠抗His标签抗体杂交，再与带有荧光Cy3标记的抗体杂交，在绿光激发下观察细胞呈鲜红色，说明IFN-γ在青鱼鳍条细胞中被正确表达。本研究结果为进一步探讨青鱼IFN-γ的时序表达特征及其抗感染防御机制奠定了基础。

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Clone and expression of interferon gamma (IFN-γ) in black carp,Mylopharyngodonpiceus

ZHOU Yong1,2,3,FAN Yuding1,HUANG Lili4,ZENG Xianhui4,ZHANG Xueping3,ZHANG Linlin3,ZENG Lingbing1

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience,Wuhan，Hubei430223,China; 2ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticDevelopment,HuzhouNormalUniversity,Huzhou,Zhejiang313000,China; 3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China; 4CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

【Objective】 This study cloned black carp (Mylopharyngodonpiceus)IFN-γgene and analyzed its structural features and expression profiles.【Method】 Using cDNA RACE,the 5′ and 3′ terminal sequences ofIFN-γgene cDNA were obtained from black carp.Then,the specific primers were designed and the full length ofIFN-γcDNA of black carp was cloned.The nucleic acid sequence and its coded amino acid sequence were analyzed by bioinformatics,homology comparison,phylogenetic tree,and expression profiles.Finally,the eukaryotic expression vector of the IFN-γ gene was transfected into black carp fin cells for expressioninvitro.【Result】 TheIFN-γcDNA sequence consisted of 549 bp,encoding a putative protein of 182 amino acids. This IFN-γ was only 1.5%-7.7% similar to its counterparts in higher vertebrates and 16.3%-92.9% similar to those in other teleost fish. Sequence analysis revealed that the black carp IFN-γ contained the typical IFN-γ motif ([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]) and a conserved nuclear localization site (RRRR) in the C-terminal end and displayed seven alpha-helix structures similar to mammalian IFN-γ.The expression ofIFN-γincreased in the kidney,spleen,gills,head kidney,and skin after the poly I:C stimulation.TheIFN-γgene was cloned into the pcDNA3.1 (+) eukaryotic expression vector and expressed in black carp fin cells.【Conclusion】 The black carpIFN-γcDNA was successfully cloned.The expression ofIFN-γwas significantly increased in kidney after poly I:C stimulation andIFN-γgene was expressedinvitro.

Mylopharyngodonpiceus;IFN-γgene;molecular characterization;expression profile

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.007

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.014.html

2015-05-19

国家“大宗淡水鱼产业技术体系建设专项”(CARS-46-11)；浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室开放基金项目(SS201403)

周 勇(1984-)，男，湖北荆州人，助理研究员，硕士，主要从事水产养殖病害研究。E-mail:zhouy@yfi.ac.cn

曾令兵(1962-)，男，湖北仙桃人，研究员，博士，博士生导师，主要从事水产养殖病害研究。E-mail:zlb@yfi.ac.cn

Q786

A

1671-9387(2016)11-0047-08