零售肉品中产气荚膜梭菌的检测与定型：以陕西关中地区为例

姜艳芬，王清爱

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 陕西镇巴县畜牧兽医工作站， 陕西 镇巴 723600)



零售肉品中产气荚膜梭菌的检测与定型：以陕西关中地区为例

姜艳芬1，王清爱2

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 陕西镇巴县畜牧兽医工作站， 陕西 镇巴 723600)

【目的】 检测陕西关中地区肉品中的产气荚膜梭菌，并进行血清型和产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因型鉴定，初步掌握该地区肉品中产气荚膜梭菌的污染状况。【方法】 从陕西西安、杨凌、武功等地的超市、农贸市场、肉食品小摊随机采集新鲜生熟鸡、猪肉及其制品，共计314份，经细菌分离纯化、染色镜检、生化试验和单重PCR检测确定分离菌株为产气荚膜梭菌，应用多重PCR检测分离菌株的血清型并进行cpe毒素基因检测。【结果】 样品中产气荚膜梭菌检出率为45.86%，且均为A型cpe产气荚膜梭菌，其中熟肉制品、生鲜肉检出率分别为50.91%和43.14%；鸡肉、猪肉检出率分别为53.06%和33.90%。【结论】 陕西关中地区的肉品中存在产气荚膜梭菌污染，建议针对可能引起产气荚膜梭菌污染和大量繁殖的环节采取更有效的预防措施。

产气荚膜梭菌；多重PCR；零售肉品检测；菌株血清型

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种条件性致病菌，广泛存在于自然界的水源、土壤及人和动物肠道之中,它主要引起人的食物中毒[1-2]、抗生素相关性腹泻(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)及动物的腹泻[1]和猝死症等，严重威胁动物及人类公共卫生安全。产气荚膜梭菌感染家禽后主要引发坏死性肠炎(Necrotic enteritis，NE)，该病是鸡的一种非常重要的经济性疾病，发病率可达30%以上，病死率18%～31%，世界范围内所有的家禽生产国均有报道，估计每年能造成国际家禽业损失约20亿美元[3-4]。产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)主要由A 型产气荚膜梭菌产生，部分C 型、D 型、E型也能产生[5-6]，是该菌非常重要的一种致病毒素，可致人食物中毒及多种动物的腹泻(ADD)和非食物中毒性胃肠道疾病[1,7]。目前在西方国家，由 A 型cpe+产气荚膜梭菌引起的食物中毒病例已位居食物中毒病例的第2 位[1]，占总病例的10%，在美国约占细菌性食物中毒的30%，每年因该菌引起的食物中毒约近10 000人[8]。

国内鲜有产气荚膜梭菌引起食物中毒的相关报道[9]，肉品中产气荚膜梭菌的污染[10-11]及该菌与食物中毒关系的系统研究也较少[12]。尤其随着社会的发展，人们生活节奏的加快和生活方式的变化，以及卫生条件和饮食习惯等因素的影响，有必要对肉品中产气荚膜梭菌对人类健康的危险性进行评估。因此，了解和掌握生鲜鸡、猪肉类及其制品中产气荚膜梭菌的污染状况，对改善我国畜禽养殖和保证肉类产品质量安全性，进而保护人类健康有重要意义。本研究随机采集不同地区、不同来源、不同种类生熟肉品，进行产气荚膜梭菌的分离和纯化，并应用多重PCR对菌型进行鉴定，以初步了解和掌握肉类产气荚膜梭菌的菌型、动态分布以及携带的毒素基因，从而预测肉制品引起人类食物中毒的可能性，为产气荚膜梭菌引起疾病的流行病学研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 标准菌株 产气荚膜梭菌B型菌(CVCC56)、 C型菌(CVCC59)、 D型菌(CVCC84)、E型菌(CVCC90)均购于中国兽医微生物菌种保藏中心；产气荚膜梭菌A型菌由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室保存。

1.1.2 试剂及培养基 10×buffer (含Mg2+)、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Ladder均为中国Thermo Scientific公司产品，Tris Base为美国Angus chemical公司产品，EDTA为美国Amresco公司产品，AN025A厌氧产气袋为英国OXOID公司产品。

液体巯基乙醇酸盐培养基(FTG)、TSC琼脂(Tryptose Sulfite-Tyloserine Agar )、营养琼脂，均为北京奥博星生物技术有限公司产品；5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板、牛乳发酵试验培养基等，均按常规方法制备。

1.1.3 仪器设备 YQX-Ⅱ厌氧培养箱，宁波江南仪器厂；AG0025A厌氧罐，英国OXOID公司；50i显微成像系统，上海光学仪器进出口有限公司；C1000 PCR扩增仪，德国Bio-RAD公司；EPS-300电泳仪和DYY-1型水平电泳槽，北京六一仪器厂；Gene genius凝胶成像系统，美国SYNGENE公司；GNP 9080电热恒温培养箱，上海景宏实验设备有限公司；AUY220分析天平，Sartorius公司；微量移液器3111，德国Eppendorf公司。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集 2013-03-2014-06分别从陕西杨凌区、武功县、西安市等地连锁超市、农贸市场、肉食品小摊无菌随机采集鲜肉和冷鲜肉(鸡肉、猪肉)及腊肠、腊肉、卤鸡爪等生熟肉制品共计314份，每个摊点、每种样品仅采集1份，样品密封并放至冰盒保存，尽快送至实验室。

1.2.2 细菌的分离与纯化 分别无菌称取约25 g样品，将样品用灭菌后的手术剪剪碎置于无菌均质袋，按照(1∶5)～(1∶10) 的比例(质量体积比)加入液体巯基乙醇酸盐培养基(FTG)，用拍击式均质器拍打1～2 min制成样品匀液，37 ℃厌氧培养24 h，然后在严格的无菌条件下将有气泡产生的培养物划线接种至含有体积分数5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板上，37 ℃厌氧培养24～48 h。挑取在5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板上呈灰色的有典型双溶血环现象的特征菌落涂片、革兰氏染色、镜检。将镜检疑似产气荚膜梭菌再划线接种于TSC琼脂培养基，42 ℃厌氧培养24 h后挑取典型的黑色菌落，1/2接种在普通营养琼脂上，置于37 ℃有氧条件下培养24 h，检测该菌是否纯化；另1/2接种于5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板，43 ℃厌氧培养24 h，取出后置于有氧环境1 h，染色镜检并观察菌落特征。每个样品选择2～3个纯化菌株用于试验。无菌挑取已纯化的菌落接种于含铁牛乳培养基,37 ℃培养8～10 h后，观察并记录结果。

1.2.3 分离菌株的单一PCR检测 引物序列参考文献[13]，cpa-F：5′-ATGAGCTTCAATTAGGTTCTACT-3′；cpa-R：5′-ATCAGCATAAAAATCCTCATT-3′。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，预期扩增产物长度为398 bp。分别以分离纯化菌株的单个菌落的1/2作为PCR反应模板。PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，Taq酶0.3 μL，分别挑取各纯化菌株的单个菌落的1/2溶于PCR反应体系作为模板，加灭菌ddH2O补至25 μL。PCR扩增程序：先在PCR管中加入除Taq酶以外的其他成分94 ℃预变性10 min；冰浴2 min之后加入Taq酶继续以下循环，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。试验同时设灭菌ddH2O作模板为阴性对照，A型产气荚膜梭菌标准菌株菌落为阳性对照。取10 μL PCR产物与2 μL 6×loading buffer混合,在2%琼脂糖凝胶中以90 V的电压电泳40 min，用凝胶成像系统观察结果并拍照。

1.2.4 产气荚膜梭菌分离菌株血清型鉴定 将经单一PCR检测确定为产气荚膜梭菌菌落的另1/2无菌接种于5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板或FTG培养基，37 ℃ 培养24 h，应用西北农林科技大学兽医公共卫生与畜禽产品安全实验室已建立的多重PCR方法[14]进行菌株的血清型鉴定。根据产气荚膜梭菌产生α、β、ε、ι 4种致死性毒素(编码基因分别为cpa、cpb、etx、ia)的能力，将其分为5种血清型，即A、B、C、D、E型。其中，A型产生α毒素，B型产生α、β和ε毒素，C型产生α和β毒素，D型产生α和ε毒素，E型产生α和ι毒素。分别以cpa、cpb、etx、ia毒素基因的特异性基因序列为目标片段，参考文献[14-17]设计并合成引物(表1)。 多重PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTPs 3 μL，上、下游混合引物(cpa、cpb、etx、ia)各为 2.15 μL，Taq酶0.5 μL，分别挑取经单一PCR鉴定为产气荚膜梭菌的单个菌落(或1 μL 24 h培养的FTG菌液)溶于PCR体系作为反应模板，灭菌ddH2O 补至25 μL。PCR扩增程序：先在PCR管中加入除Taq酶以外的其他成分94 ℃预变性10 min；冰浴2 min之后加入Taq酶继续以下循环，94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min 50 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。试验设灭菌ddH2O作模板为阴性对照，B+E型产气荚膜梭菌标准菌株菌落为阳性对照。取10 μL PCR产物与2 μL 6×loading buffer混合,在2%琼脂糖凝胶中以90 V的电压电泳40 min，用凝胶成像系统观察结果并拍照。

表 1 PCR引物序列

1.2.5cpe毒素基因的检测 引物序列参考文献[17](表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，预期扩增产物长度为233 bp。PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，分别挑取各菌株单个菌落作为PCR反应模板，灭菌ddH2O补至25 μL。PCR扩增程序：先在PCR管中加入除Taq酶以外的其他成分94 ℃预变性5 min；冰浴 2 min之后加入Taq酶继续以下循环，94 ℃ 50 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。试验同时设灭菌ddH2O为阴性对照，PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以90 V的电压电泳40 min，用凝胶成像系统观察结果并拍照。

1.3 统计分析

所有样品的产气荚膜梭菌的检出率均运用IBM SPSS Statistics 21.0χ2检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的培养特征

镜检可见G+呈粗杆状，两端钝圆，单个、成双或短链，有荚膜的梭菌，横径稍大于菌体，呈卵圆形梭状芽胞杆菌(图1-a)。5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板上呈灰色、边缘整齐、表面光滑的圆形菌落；在空气中暴露一段时间后，菌落变为浅绿色，菌落周围呈大小不一的单环或双环溶血(图1-b)。TSC琼脂平板上形成黑色菌落，且菌落周围有乳白色浊环(图1-c)。牛乳“暴烈发酵”试验阳性(图1-d)。初步从314份样品中分离鉴定出396株疑似产气荚膜梭菌菌株。

a.显微镜下的形态特征(10×100)；b.5%鲜血-葡萄糖-琼脂平板上的菌落特征；c.TSC琼脂平板上的菌落特征；d.牛乳“暴烈发酵”(左为阴性对照，右为阳性)

2.2 分离菌株的单一PCR检测结果

所有分离菌株均扩增出了与阳性对照片段长度一致的约398 bp的目的条带(图2)，确定这些分离菌株均为产气荚膜梭菌。

M.DL2000 DNA Ladder;1.A型标准产气荚膜梭菌菌株Standard Clostridium perfringens type A;

2.3 产气荚膜梭菌分离菌株的血清型鉴定结果

产气荚膜梭菌分离菌株的血清型鉴定结果显示，以B+E型产气荚膜梭菌标准菌株(携带α、β、ε、ι)为阳性对照，396株分离菌株均仅扩增出1条325 bp的特异性条带(图3)，确定本研究分离到的菌株均为A型产气荚膜梭菌。

2.4cpe毒素基因检测结果

cpe毒素基因检测结果表明，396株A型菌均未扩增出预期目的条带，仅阳性对照E型参考菌株扩增出了与预期目的条带长度(约233 bp)一致的条带(图4)，说明所有的分离菌株均为cpe-菌。

1～2.分离菌株;M.DL2000 DNA Ladder(从上至下依次为2 000，1 000，750，500，250，100 bp);3.E型菌株1-2.Isolates;M.DL2000 DNA Ladder (from top to bottom:2 000,1 000,750,500,250,100 bp);3.Clostridium perfringens type E

本研究从314份生熟鲜肉及肉制品中共分离鉴定出396株产气荚膜梭菌，检出率达45.86%。鸡肉样品的检出率为53.06%(104/196)，其中鸡翅样品的检出率最高，为62.50%(30/48)，鸡脯样品的检出率最低，为46.81%(22/47)，但鸡翅、鸡脯、鸡腿、鸡爪的检出率之间均无显著性差异(表2)。猪肉检出率33.90%(40/118)，其中腊肉检出率为0，鲜肉检出率为31.43%，腊肠检出率为50.0%(29/58)；腊肉与鲜肉和腊肠检出率之间差异极显著(P<0.01)，但是鲜肉与腊肠之间的检出率差异不显著(P>0.05)。鸡肉与猪肉检出率差异极显著(P<0.01)(表2)。熟肉制品检出率为50.91%(56/110)，生鲜肉样品检出率为43.14%(88/204)，二者无显著性差异(P>0.05)。

表 2 肉品中产气荚膜梭菌分离与鉴定结果

注：同列数据后标不同大写字母表示χ2检验有极显著性差异(P<0.01)。

Note:Different capitalization superscripts in each column mean significant difference by chi-squared test (P<0.01).

3 讨 论

本研究通过对314份肉样进行细菌分离纯化、血清型鉴定和cpe毒素基因的检测，初步明确了陕西关中部分地区日常肉品中产气荚膜梭菌菌型的污染情况。从肉品种类来看，鸡肉检出率为53.06%，其中以鸡翅检出率最高(62.50%)，鸡脯检出率最低(46.81%)；猪肉检出率为33.90%，其中腊肠、鲜猪肉、腊肉的检出率分别为50.0%，31.43%和0，由此看来，无论猪肉还是鸡肉都存在产气荚膜梭菌的污染，这可能是由于生鸡和生猪的屠宰加工、运输贮藏以及肉制品加工过程受到了不同程度的污染。

产气荚膜梭菌的芽孢耐热性很强，90 ℃、30 min才能将其杀死，理论上讲，熟肉制品检出率应该小于生肉，因为经过烹饪、蒸煮等处理微生物会被完全或部分杀死，但本研究检测结果显示熟肉污染率(50.91%)高于生肉(43.14%)，这可能是熟肉在蒸煮加工过程中并未完全杀死肉品中产气荚膜梭菌，肉品加工成熟后储藏时间过长或存放在较高温度使得细菌能够继续生长繁殖，以及盛放的容器或包装受到污染等原因所致。值得注意的是，腊肉样品中未能分离到产气荚膜梭菌，这可能与腊肉的加工方法有关。因此，食品加工过程中应当采取更加严格的控制措施，降低加工后期污染的可能性。

本研究结果表明，关中地区的鸡肉中产气荚膜梭菌污染较为严重，检出率为53.06%(104/196)，比梁光军等[10]检测的鲜鸡肉中该菌的分离率25%(7/28)高，但比国外文献报道该菌的分离率66%～100%[17-19]低，说明我国零售鸡肉的产气荚膜梭菌的污染程度与西方国家相比较低，这可能与我国目前还普遍将抗生素作为预防用药添加在饲料中长期使用的饲养管理方式有关。本研究分离到的产气荚膜梭菌均为A型产气荚膜梭菌，未发现其他各型(B、C、D、E型)产气荚膜梭菌，结果与前期的报道[10,17-18]相吻合。

A型产气荚膜梭菌引起的人类食物中毒与CPE毒素有关[20]，约0～5%的产气荚膜梭菌携带cpe基因[2,21]，美国[22]、日本[23]、土耳其[18]的产气荚膜梭菌分离cpe基因携带率分别为1/147，1/55和1/545。但是本研究在分离到的396株产气荚膜梭菌中并未检测到cpe基因。这与Nowell等[17]在零售鸡肉样品中未检测到cpe基因阳性菌株，Cooper等[19]在零售鸡肉的肝脏分离菌株中也未检测到cpe基因结果吻合，说明cpe基因在鸡肉的分离菌株中不常见。本研究结果与cpe基因在鸡源性菌株较少见的研究结果相符。说明鸡肉不是引起人类食物中毒的产气荚膜梭菌的主要来源。

本研究中鲜猪肉产气荚膜梭菌检出率为31.43%(11/35)，与江苏省的结果(37.9%)[10]较为相近，但高于贵阳市的分离率(6.25%)[11]。梁光军等[10]在熟猪肉制品和熟鱼制品中共检出了2株cpe+-A型产气荚膜梭菌，检出率为2.1%。而本研究中并未在猪肉样品中检测到携带cpe基因的A型产气荚膜梭菌。本试验在E型菌株中检测到cpe基因，证明E型菌也能产生CPE毒素[5-6,24]。

产气荚膜梭菌作为一种重要的致人食物中毒的病原菌，其危害不容小觑，疾控和卫生监督人员在食物中毒处置工作中对此菌应引起足够的重视。建议卫生行政部门及政府决策机构针对可能引起产气荚膜梭菌污染和大量繁殖的环节采取更有效的预防措施，以保证广大民众的身心健康。

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Detection and typing ofClostridiumperfringensfrom retail meat in Guanzhong,Shaanxi

JIANG Yanfen1,WANG Qing’ai2

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China；2ZhenbaAnimalHusbandryandVeterinaryStation,Zhenba,Shaanxi723600,China)

【Objective】 To understand the contamination and distribution ofClostridiumperfringens(C.perfringens) in raw or cooked retailed meat in Guanzhong,Shaanxi,C.perfringensstrains were isolated from collected retailed meat samples,and serotyped using established multi-PCR. 【Method】 A total of 314 samples including fresh raw meat (chicken and pork),cooked chicken claws,sausage and preserved pork were purchased randomly from supermarkets,farmer’s markets and food stands in Xi’an,Yangling and Wugong.Samples were isolated and purified as suspectC.perfringensstrains.The isolates ofC.perfringenswere then confirmed using Gram staining,biochemical test,PCR amplification and serotyped by the developed multiplex PCR and genotyped bycpegene detection.【Result】 The isolation rate ofC.perfringenswas 45.86% and all isolates were classified ascpe-type A.C.perfringensidentification rates in cooked meat samples and raw fresh meat samples were 50.91% and 43.14%,while the rates in chicken and pork were 53.06% and 33.90%,respectively.【Conclusion】 This study demonstrated the presence ofC.perfringensin meat products in Guanzhong,Shaanxi,and it is suggested to take more effective preventive measures to control contamination and mass proliferation ofC.perfringens.

Clostridiumperfringens;multi-PCR;retail meat detection;strain serotype

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.008

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.016.html

2015-06-02

西北农林科技大学基本科研业务费创新专项(QN2012019)

姜艳芬(1972-)，女，陕西米脂人，副教授，博士，主要从事分子病原学与免疫学研究。E-mail:jyf1111@nwsuaf.edu.cn

S855.1

A

1671-9387(2016)11-0055-06