不同培养条件下滨梅幼苗对NaCl胁迫的响应

朱 泓，胡淑英，张春红，王小敏，吴文龙，李维林

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏 南京 210014)



不同培养条件下滨梅幼苗对NaCl胁迫的响应

朱 泓，胡淑英，张春红，王小敏，吴文龙，李维林

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏 南京 210014)

【目的】 比较不同培养条件下滨梅幼苗耐盐特性差异，并筛选出耐盐能力强的滨梅品种，从而为滨梅耐盐性评价提供依据。【方法】 以不同种源滨梅组培试管苗为试验材料，分别在组培和水培条件下，以0，100，200 mmol/L NaCl进行盐胁迫处理，通过观察测定不同种源滨梅叶片盐害及生理生化指标，分析不同培养条件下滨梅幼苗对NaCl胁迫的响应情况。【结果】 盐胁迫7 d后，组培和水培滨梅幼苗叶片中Na+、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)含量、相对电导率(REC)及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性均随NaCl处理浓度的升高显著增加；5种不同来源滨梅幼苗材料盐胁迫生理指标差异显著，其耐盐性强度表现为MI

滨梅；组织培养；水培；NaCl胁迫；耐盐性

滨梅(PrunusmaritimaMarshall)是蔷薇科李属的一种盐生灌木，其根系发达，具有耐旱、耐贫瘠、耐盐碱等方面的抗逆性，可用于海岸滩涂修复和沙丘固定，是一种花果两用的耐盐新经济树种[1-2]。与扦插繁殖相比，滨梅组织培养具有生长速度快、遗传性状稳定等优点，可作为构建滨梅耐盐性快速评价体系的基础。迄今为止，滨梅组织培养技术和耐盐生理研究已取得了一定进展[3-9]，但仅有少数基于组织培养的耐盐性评价和研究[10]。为此，本研究设计了基于组织培养和水培条件的NaCl胁迫试验，并对不同浓度NaCl胁迫下，不同种源滨梅幼苗生长和生理响应变化规律进行了研究，以期为滨梅的耐盐性评价提供快速有效的方法学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滨梅材料：从美国纽约、密歇根、马萨诸塞(其中马萨诸塞引进两批，分别来源于Sandwich和Cape Code)引进的滨梅种子，当年播种，9月份以种子苗半木质化枝条作为外植体进行组织培养；从江苏南京溧水区傅家边引进的滨梅材料，以其1年生半木质化枝条作为外植体进行组织培养。对5个来源地的滨梅材料进行编号，分别为美国纽约(NY)、密歇根(MI)、Sandwich(MA1)、Cape Code(MA2)、南京(NJ)。

试验仪器：Thermo Scientific Orion Star A，Molecular Devices SPECTRA max PLUS 384。

试验试剂：磷酸缓冲液(pH 7.4)，H2O2，体积分数95%乙醇。植物丙二醛(MDA)测定试剂盒、过氧化物酶(POD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法测定试剂盒、钠测试试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

通过组培方式繁殖试管苗，每个种源选取30株生长健壮的试管苗，接种在添加0，100，200 mmol/L NaCl的1/2MS+NAA 0.2 mg/L培养基中(每处理10株)[5]，接种后第7 天取展开的第3片功能叶测定生理生化指标，同时每隔10 d观察一次组培苗的受害症状，共观察4次，最后进行受害性状汇总；每个种源再选取12株生长健壮的试管苗接种在1/2MS+NAA 0.2 mg/L培养基中，约35 d后生根，将生根的组培苗移出试管进行水培(每处理4株)，水培溶液分别添加0，100，200 mmol/L NaCl，水培第7天取展开的第3片功能叶测定生理生化指标，同时每隔3 d观察一次滨梅组培苗的受害症状，共观察5次，最后进行受害性状汇总。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 盐害指标 参照阎艳霞等[11]和杜中军等[12]的标准，以滨梅叶片颜色变化和脱落情况进行盐害等级划分，0级：叶片颜色和生长正常；1级：少量叶尖、叶缘变黄；2级：部分叶片变黄，萎蔫，有少量叶片脱落；3级：大部分叶片变黄，萎蔫干枯，有明显落叶；4级：叶片脱落十分严重或者死亡率超过50%。

1.3.2 生理生化指标 采用电导法[13]测定相对电导率(REC)；采用试剂盒测定滨梅叶片可溶性蛋白(SP)、丙二醛(MDA)、Na+含量和抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性。每个样品均设3个重复。

1.4 数据处理

试验数据用 Excel 2010 和SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用Duncan’s法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫对滨梅幼苗生长的影响

在组培条件下，所有单株在添加100 mmol/L NaCl的培养基上总体长势都较正常，其中MA2种源在100 mmol/L NaCl处理下，生长势基本上没有受到影响，只是生根晚于对照(0 mmol/L NaCl)处理(对照处理的单株一般7 d左右开始生根，而100 mmol/L NaCl处理的需要20 d)；MI种源耐盐能力明显相对较差，在100 mmol/L NaCl处理过程中，20 d后开始出现少量叶尖、叶缘变黄，40 d后部分叶片变黄、萎蔫，有少量叶片脱落。在添加200 mmol/L NaCl的培养基中，几乎所有材料在处理后的第4 天叶片开始发黄，20 d后部分材料茎段开始枯黄，到40 d后MI和MA1的死亡率超过50%，其他种源在40 d时大多数叶片变黄，萎蔫干枯，伴有落叶现象。

在水培条件下，在添加100 mmol/L NaCl的水溶液中，MA2基本未受NaCl胁迫影响；NY和NJ的叶尖、叶缘有些发黄，到第4、5次观察时有少量叶片脱落；MI和MA1材料在起始观察时即发现叶片变黄，后2次观察时少量叶片开始脱落。在添加200 mmol/L NaCl的水溶液中，MI种源生长势明显弱于其他材料，在第2次观察时就发现大量落叶，第4、5次观察时植株开始死亡；NY、MA1、NJ材料在第2次观察时，叶片开始发黄和脱落，第4、5次观察时大部分叶片变黄，有明显落叶现象，MA1有部分植株死亡；MA2种源在前3次观察时长势都比较正常，仅少许叶片叶缘有些发黄，第4、5次观察时大部分叶片变黄，有明显落叶现象，但植株没有死亡。

从表1可以看出，5个种源的滨梅幼苗耐盐性存在一定差异。无论是在组培还是水培条件下，MA2种源的耐盐性较强(可耐受200 mmol/L NaCl)，而MI较弱(仅可耐受100 mmol/L NaCl)，5个种源材料的受害表现为MA2

表 1 不同培养条件下NaCl 处理后滨梅幼苗受盐害等级

2.2 NaCl胁迫对滨梅扦插苗生理指标的影响

2.2.1 叶片丙二醛和可溶性蛋白含量及细胞膜透性的变化 由表2可以看出，经不同浓度NaCl处理后，组培和水培条件下滨梅幼苗叶片中MDA含量均随NaCl浓度增加呈上升趋势，100 mmol/L NaCl处理7 d后，除组培MA2样品与对照差异不显著外，所有处理组幼苗叶片中的MDA含量均显著高于对照；200 mmol/L NaCl处理7 d后，MDA含量与对照及100 mmol/L NaCl处理相比均显著增加。所有种源在无盐处理时，除组培MA1外样品间MDA含量差异不显著；在不同盐胁迫水平下，不同种源间MDA含量表现出显著差异，但组培和水培条件下不同种源间MDA含量差异排列顺序一致，均为MA2

在不同盐胁迫水平下，组培和水培滨梅幼苗叶片中SP含量变化趋势与MDA含量变化趋势一致，不同种源间SP含量差异显著，组培和水培条件下不同种源间SP含量差异排列顺序一致，均为MI

在不同盐胁迫水平下，组培和水培滨梅幼苗叶片中REC整体变化趋势与MDA和SP含量变化趋势一致，而100 mmol/L NaCl处理7 d后，仅MA1的REC值显著高于对照，该结果表明各种源均表现出较强的耐盐性。

表 2 NaCl胁迫对不同培养条件下滨梅叶片相对电导率及丙二醛和可溶性蛋白含量的影响

表 2(续) Continued table 2

注：同列数据后标不同小写字母表示不同种源在相同处理条件下差异显著(P<0.05)；“**”表示单个种源在不同NaCl处理下显著高于标记“*”和未标记处理(P<0.05)，“*”表示单个种源在不同NaCl处理下显著高于未标记处理(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significantly different (P<0.05) on same NaCl stress.The double asterisks and single asterisk indicate significant difference (P<0.05) for same provenance.Means followed by double asterisks are significantly higher than single asterisk.

2.2.2 叶片保护酶活性的变化 NaCl胁迫对不同培养条件下滨梅叶片SOD、CAT和POD活性的影响见图1～2。

图 1 NaCl胁迫对不同培养条件下滨梅叶片SOD和CAT活性的影响

Prunusmaritimeunder different culturing conditions

图 2 NaCl胁迫对不同培养条件下滨梅叶片POD活性的影响

由图1～2可见，作为植物体内保护酶系统的活性氧清除剂，除水培MI试验组CAT活性(100～200 mmol/L NaCl胁迫)以及组培MI试验组SOD活性(0～100 mmol/L NaCl胁迫)外，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性均随着NaCl浓度增加呈显著上升趋势，该结果表明盐胁迫激发了保护酶活性[14-15]，对滨梅植株细胞膜起到稳定和保护作用。无盐胁迫时，不同种源滨梅幼苗SOD和CAT及水培试验组POD活性无显著差异。随着NaCl胁迫强度的增加，SOD、CAT和POD活性发生显著变化，不同培养条件下各种源保护酶活性变化规律有一定差异，组培条件下SOD和CAT活性变化规律均为MI

2.2.3 叶片Na+含量的变化 由图3可见，随着盐胁迫强度的增加，组培和水培条件下各种源滨梅幼苗叶片中的Na+含量均显著升高；不同种源在无盐胁迫下Na+含量差异不大，而随着NaCl处理浓度增加，各种源Na+含量差异达到显著水平，且在100和200 mmol/L NaCl处理后，组培和水培条件下不同种源间Na+含量差异排列顺序相同，各种源滨梅幼苗叶片中的Na+含量从低到高分别为MA2

图 3 不同浓度 NaCl 处理下滨梅叶片钠离子含量的变化

3 结论与讨论

盐胁迫下，植物的盐害情况最直观地反映了其对不同浓度盐处理的耐受性。在100 mmol/L NaCl的胁迫下，随着胁迫时间的延长，MI和MA1等耐盐能力较弱的种源开始出现叶尖、叶缘变黄现象，逐渐发展到叶片变黄、萎蔫，叶片从下逐渐向植株顶部脱落，而种源MA2则基本未受影响；在200 mmol/L NaCl的胁迫下，几乎所有种源在短时间内开始发黄，随着胁迫时间的延长，MI和MA1植株茎段开始枯萎并伴随出现植株死亡。除此之外，植株叶片中MDA含量、REC值、SP含量、Na+含量和保护酶(SOD、CAT、POD)活性均为评价植株耐盐性的重要生理指标。本试验中，仅有MA1(组培)的这些生理指标均随盐处理浓度增加显著变化，MI(水培)、MA2(水培)以及除MA1外组培试验组叶片REC值均仅在200 mmol/L NaCl的胁迫下显著升高，该变化趋势与盐胁迫下盆栽滨梅幼苗的响应规律类似[16-18]。随着NaCl浓度的增加，滨梅叶片Na+含量显著升高，除MA2(组培)、NY(水培)、MI(水培)、MA1(水培)和NJ(水培)外，其他处理叶片可溶性蛋白含量均随盐处理浓度增加显著增加。本试验中，因盐胁迫而形成的高含量可溶性蛋白可能帮助维持植物细胞较低的渗透势，降低盐分对细胞膜系统的伤害。此外，SOD、POD、CAT 都是重要的抗氧化酶，这3种酶活性均随NaCl处理浓度的升高显著升高，能有效遏制活性氧含量的上升，避免活性氧对膜脂造成伤害。滨梅叶片中的 MDA 含量只有在高浓度盐处理下才显著增加，而低浓度盐处理时增加不明显，也表明低浓度盐处理下滨梅体内活性物质能有效地防止膜系统受到伤害。不同种源滨梅幼苗间的生理指标差异显著，其中MA2具有良好的耐盐性，在盐胁迫下具有较低的MDA含量、REC值和Na+含量，同时具有较高的SP含量和保护酶活性，植株受盐害程度最低；相比之下，MI的耐盐能力较弱，在盐胁迫下具有较高的MDA含量、REC值和Na+含量，同时具有较低的SP含量和保护酶活性，受到的盐害最为严重。经比较，本研究中5个种源滨梅幼苗的耐盐性强弱顺序为MI

植物组织培养和水培均是盐胁迫试验中的常见培养方式[19-21]。盐害试验结果表明，相同强度的盐胁迫下水培滨梅幼苗受到的盐害更强，在胁迫后植株更早地产生黄叶、萎蔫和落叶现象。尽管如此，本试验中不同种源的组培幼苗受盐害强弱顺序与水培一致；不同水平盐胁迫7 d后，相同种源组培滨梅幼苗叶片MDA含量、REC值、SP含量、Na+含量以及保护酶活性的变化规律均与水培保持一致；除保护酶外，不同种源组培滨梅幼苗的耐盐性指标强弱顺序也与水培保持一致。综上所述，滨梅幼苗的组培盐胁迫试验结果与水培盐胁迫试验结果有较高一致性。该结果暗示，在进行滨梅耐盐性评价时，为了达到快速、简便的目的，可以直接在组培条件下对试管苗进行耐盐性评估。

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Responses ofPrunusmaritimaMarshall seedlings to NaCl stress under different culturing conditions

ZHU Hong,HU Shuying,ZHANG Chunhong,WANG Xiaomin,WU Wenlong,LI Weilin

(InstituteofBotany,JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences,Nanjing，Jiangsu210014,China)

【Objective】 This research investigated the influence of salt stress on physiological characteristics ofPrunusmaritimaMarshall seedlings under different culturing conditions and selected new variety with strong salt tolerance.【Method】 Five provenances of beach plum were treated with 0,100,and 200 mmol/L NaCl under tissue and water culturing conditions to evaluate their salt-tolerance.【Result】 With the increase of NaCl concentration,MDA content,Na+content,total soluble protein content (SP),relative conductivity,and activities of superoxide dismutase (SOD),catalase (CAT) and peroxidase (POD) in leaves of seedlings were significantly increased under both tissue and water culturing conditions 7 days after treatment.The physiological indexes of the five provenances were significantly different with the salt-tolerance in order of MI

PrunusmaritimaMarshall;tissue culturing;water culturing;NaCl stress;salt-tolerance

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.010

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.020.html

2015-06-12

海洋公益性行业科研专项(201505023)；江苏省农业三项工程项目(SXGC(2015)332)；江苏省木本油料高效栽培示范项目(LYSX[2015]14)

朱 泓(1982-)，男，江苏南京人，助理研究员，理学博士，主要从事植物栽培生理研究。E-mail:gogen@yeah.net

李维林(1966-)，男，陕西汉中人，研究员，博士，主要从事植物学研究。E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net

Q494

A

1671-9387(2016)11-0070-07