神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

孟 姣，于 欢，周 斌，王 敦

(西北农林科技大学 植保资源利用与病虫害治理教育部重点实验室，陕西 杨凌 712100)



神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

孟 姣，于 欢，周 斌，王 敦

(西北农林科技大学 植保资源利用与病虫害治理教育部重点实验室，陕西 杨凌 712100)

【目的】 在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】 运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白，并用蛋白质印迹对其进行检测；测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化，并对其毒力进行测定。【结果】 通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证，神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中，且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白；此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3～12 h后，中肠膜电位与CK相比差异显著，且随着作用时间的延长，棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势，作用9 h以后，升高的幅度逐渐降低，趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12 μg/g。【结论】 在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白，且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。

棉铃虫；神经毒素基因RjAa17f；Sf9；RjAa17f毒蛋白；杆状病毒真核表达系统

棉铃虫核型多角体病毒早在1973年已经在美国环保局的批准下成为第一个注册登记的杆状病毒商品杀虫剂。虽然杆状病毒具有高度的专一性、对人畜及动物无害、对环境无污染等优点，但其也有一定的缺点，如杀虫速率相对缓慢、对高龄害虫杀虫力弱等[1]。因此，利用各种生物毒素对杆状病毒进行基因工程改造已成为主要发展方向。

生物毒素也被称为天然毒素，是由植物、动物、微生物等产生的对其他物种有毒害作用的一类化学物质[2-3]。在生物毒素中，有一种蝎毒(Scorpion venom)，它主要存在于蝎子尾刺的毒囊中，其主要成分是神经毒素，而神经毒素是引起麻痹甚至死亡的最主要成分[4-5]，并且神经毒素可以选择性地作用于不同的离子通道，被称之为蝎神经毒素。表1为几种蝎毒素基因表达产物的杀虫效果。

表 1 不同蝎毒素基因表达产物的杀虫效果

用于外源基因真核表达的杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system,BEVS),可以将目的基因整合到杆状病毒基因组后导入昆虫细胞中进行表达，这类表达所得的蛋白具有完善的翻译后修饰及同天然蛋白相同的生理活性[12]，这是细菌表达系统所不具备的[13]。

本研究所用神经毒素基因(RjAa17f)(GenBank登录号：HM233954)来自古巴黑脚朱蝎(Rhopalurusjunceus)的毒液，其编码的蛋白质RjAa17f对节肢动物有特异毒性，该毒素蛋白对小鼠没有毒害现象，而对蟋蟀有明显的致死效应[14]，但其机理并不清楚。本研究利用真核表达系统表达出RjAa17f毒蛋白，将该毒蛋白作用于棉铃虫中肠，测定棉铃虫中肠膜电位的变化，并对其毒力进行测定，以期为阐明该神经毒素杀虫作用机理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材 料

棉铃虫卵及人工饲料均购于河南济源白云实业有限公司。供体质粒pFastBac-HTb、大肠杆菌(Escherichiacoli)TG1，均为西北农林科技大学昆虫研究所保存。昆虫草地夜蛾细胞(Sf9)、E.coliDH10Bac(含有苜蓿银纹夜蛾AcMNPV人工细菌染色体Bacmid(bMON14272)和辅助质粒pMON7124)，均由浙江大学张传溪教授馈赠。含有HearNPV基因组(HaBacHZ8)的菌株E.coliBW25113，由中国科学院武汉病毒研究所胡志红研究员馈赠。RjAa17f全基因(GenBank登录号：HM233954)委托上海冠旭公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 重组转座载体、重组穿梭载体的构建 根据引物设计原则，参照RjAa17f基因的cDNA全序列及供体质粒pFastBac-HTb，选择的酶切位点分别是BamHⅠ和HindⅢ(酶切位点下划线斜体标出)。

RjAa17f-F：5′-CGGATCCATGAAGATTTT-GATATTCATC-3′(28 bp)；

RjAa17f-R：5′-CAAGCTTTTATCCTCTAC-ATTTAATGTTGC-3′(30 bp)。

通过BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，将连在T载体的RjAa17f基因通过酶切、连接、割胶回收、转化等方法克隆进入供体质粒载体pFastBac-HTb，采用酶切进行鉴定，构建成重组转座载体RjAa17f-HTb。将构建好的RjAa17f-HTb转化到DH10Bac菌株，在包含50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素、10 μg/mL 四环素、100 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG 的LB琼脂糖平板上进行DH10Bac转化株的蓝白斑筛选。挑选10个白色的克隆，重新在含有上述抗生素和显色试剂的LB琼脂糖平板上划线，37 ℃培养48 h。再次选出白色单克隆，转接至含有50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素、10 μg/mL 四环素的液体培养基中，200 r/min、37 ℃培养24 h后，根据Bac-to-BacTM(Invitrogen，USA)提取重组质粒，并用M13引物(M13-F：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′和M13-R：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)进行PCR鉴定，确定获得的重组子为单一的RjAa17f-Bacmid病毒基因组。

1.2.2Sf9细胞的培养及重组杆状病毒质粒的转染Sf9细胞的培养是用SFX昆虫培养基(SIGMA)补加100 μg/mL 氨苄青霉素、50 μg/mL 链霉素、1%的胎牛血清，置于27 ℃培养，约72 h细胞即处于对数生长期。

挑选单层贴壁生长状态良好的Sf9细胞，铺在准备好的24孔板，置于27 ℃培养至对数生长期。将制备好的RjAa17f-Bacmid DNA和转染试剂(Roche,Switzerland)及无抗生素的培养基以1∶1∶50，2∶1∶50混合，静置45 min。将预先混匀的DNA和转染试剂加入已准备好的含有单层贴壁生长状态良好Sf9的24孔板中，摇晃5～10 s，混匀。27 ℃培养3～7 d，观察转染效果，确定感染正常后收集病毒上清液用于后续感染扩繁含有RjAa17f的重组病毒。以等量未重组Bacmid转染Sf9细胞获得对照Bacmid病毒。

1.2.3 病毒的大量制备 收集转染后的病毒上清液，逐级扩大培养扩增病毒，即取1 mL加入单层贴壁生长状态良好的Sf9细胞中，再加入1 mL含血清的SFX培养基，温和混匀后于27 ℃培养5 d。6孔板如此反复，扩增病毒和提高病毒滴度，用于后续感染分析和重组蛋白生产。

1.2.4 蛋白质印迹(Western blot)鉴定目的蛋白的表达 用含有RjAa17f的重组病毒感染Sf9细胞 120 h后，将细胞用PBS(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO48 mmol/L、KH2PO41.5 mmol/L，pH 7.4)清洗3次，2 000 r/min离心10 min后收集细胞，然后用沸水煮蛋白样品10～15 min，通过SDS-PAGE进行分离。电泳后凝胶上的目的条带用电转移法印迹到硝酸纤维素滤膜上，转移电压为9 V 30 min。转移完毕后取出NC膜置于封闭液(20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20)中，摇床培养2～3 h。然后加入抗his标签鼠抗作为一抗(Abcam,England )4 ℃孵育，过夜，比例为1∶2 000，然后TBST洗3次，每次5 min；二抗：羊抗鼠(Abcam,England )，比例为1∶5 000，摇床培养1 h，然后TBST洗3次，每次5 min。通过化学发光试剂盒(Thermo Scientific Pierce ECL,USA)显色，荧光及化学发光成像系统2950 MI (Clinx Science Instruments,China)照相。

1.2.5 RjAa17f毒蛋白的制备与中肠电生理测定 (1)RjAa17f毒蛋白的制备。RjAa17f毒蛋白通过杆状病毒表达系统进行表达。用含有基因组RjAa17f的重组病毒大量感染健康的对数期Sf9细胞，感染120 h后收集感染后的细胞，加PBS溶液，500g×10 min、4 ℃反复离心，弃上清，加PBS溶液混匀、涡旋后进行超声波破碎，强度30%，破碎5 s、间隙5 s，破碎5 min。离心除去沉淀，上清液即为RjAa17f毒蛋白粗液。以等量对照Bacmid病毒感染的Sf9细胞为对照，蛋白粗液制备方法相同。制备RjAa17f毒蛋白粗液和Bacmid病毒感染Sf9细胞蛋白粗液用于后续生物活性测定。

(2)中肠电生理测定。选取末龄健康棉铃虫，体质量为60～80 mg/头，30头为1个重复，重复3次。每头棉铃虫饥饿过夜后注射10 μL RjAa17f毒蛋白粗液，以注射10 μL Bacmid病毒感染的Sf9细胞蛋白粗液为空白对照；分别在注射后3，6，9，12 h解剖试虫，取出中肠用毛细管吸附，使中肠尾端包裹于毛细管口处，用正负极探针刺入中肠膜，通过Axoclamp 900A(Axon Instrument，Foster City，CA)电位仪器测定膜电位。测定数据由连接该仪器的计算机收集，并通过Origin 9.0软件进行制图。

1.2.6 RjAa17f毒蛋白的毒力测定 挑选健康的3龄棉铃虫进行RjAa17f毒蛋白毒力测定。将RjAa17f毒蛋白用PBS溶液进行稀释，稀释后质量浓度分别为0.375，0.75，1.5，3，6和12 mg/mL。在低温(4 ℃)处理3龄棉铃虫30 min后，用微量注射器将稀释后的毒蛋白注射到虫体的前胸背板，每头棉铃虫注射2 μL，每处理注射20头，重复3次。以注射生理盐水为对照。处理后将试虫置于24 ℃的培养室饲养,相对湿度75%～85%，每隔2 h观察并记录棉铃虫死亡数。以注射后72 h死亡虫数计算毒力回归方程、致死中量(LD50)、LD50值的95%置信限等。

2 结果与分析

2.1RjAa17f-HTb的酶切鉴定

查询GenBank中神经毒素基因RjAa17f的已知序列，并根据本试验的需要在基因RjAa17f两端引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，基因RjAa17f与供体质粒pFastBac-HTb相连后，酶切结果如图1所示，在252 bp得到1条清晰的条带，与预期的结果一致，经过测序与原序列一致。表明神经毒素基因RjAa17f已成功与pFastBac-HTb载体相连。

2.2 转化到DH10Bac菌株的PCR鉴定

查询Bac-to-Bac表达系统可知，含有神经毒素基因RjAa17f的重组质粒片段大小为2 430 bp，加上插入的目的基因片段，即为2 682 bp，经过几轮划线纯化后，通过M13-F/M13-R的鉴定，筛选出纯转座子。由图2可知，RjAa17f-Bacmid的PCR与预期的结果一致，说明得到含有神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid。

图 1 RjAa17f-HTb的酶切鉴定

图 2 RjAa17f重组Bacmid的PCR鉴定

2.3 重组杆状病毒质粒的转染

将构建好的RjAa17f重组Bacmid转染至贴壁培养的Sf9细胞，24 h后开始观察细胞形态的变化。如图3所示，转染24 h后，细胞直径增加、细胞核增大；转染24～72 h后细胞开始出现脱壁现象；转染72 h后，被感染的细胞数量明显增多，大部分细胞开始呈现脱壁现象并上浮。这说明神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中。

图 3 光学显微镜下RjAa17f-Bacmid感染后的Sf9细胞(60×)

2.4 蛋白质印迹(Western blot)检测毒素蛋白RjAa17f的表达

收集RjAa17f-Bacmid转染后120 h的Sf9细胞进行蛋白检测。神经毒素基因RjAa17f表达的毒蛋白再加上6×His标签的蛋白大小为16.2 ku左右。由图4可知，RjAa17f毒蛋白感染细胞可明显看到与预测条带大小一致的阳性条带，说明神经毒素基因RjAa17f已经在Sf9细胞中成功表达。

2.5 RjAa17f毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位的作用

以注射后时间为x轴、棉铃虫中肠膜电位为y轴，通过Origin9.0软件进行作图，结果见图5。由图5可知，CK试虫的电位在-50～-60 mV，注射RjAa17f毒蛋白后，棉铃虫中肠膜电位呈现逐步升高的趋势，随着时间的变化，升高的幅度逐渐降低，最后趋于平缓。

图 4 蛋白质印迹检测毒素蛋白RjAa17f的表达

图 5 RjAa17f毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位的作用

2.6 RjAa17f毒蛋白的毒力测定

RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的毒力回归方程为Y=1.93+1.52X，相关系数r=0.98，LD50为108.12 μg/g，95%水平的置信区间为75.68～161.34 μg/g。

3 讨论与结论

编码整合有神经毒素基因的杆状病毒可以提高杆状病毒对鳞翅目害虫的杀虫速度，例如螨类毒素TxP-1[15]、蜘蛛毒素Av-Tox2[16]、东亚钳蝎毒素BmKIT[9]等，这些重组病毒加快了昆虫的死亡，减少了昆虫取食量，引起昆虫肌肉麻痹，但对其作用机理的研究甚少。为进一步明确神经毒素对鳞翅目幼虫的致毒机理，本研究通过真核表达系统在Sf9细胞中成功表达了RjAa17f毒蛋白，通过组织电极测定发现RjAa17f毒蛋白作用于棉铃虫后，棉铃虫中肠膜电位显著升高，而注射对照蛋白液的棉铃虫中肠膜电位则没有发生变化。这说明RjAa17f毒蛋白能直接作用于鳞翅目幼虫的中肠，导致其膜电位的升高，使得中肠跨膜电位差缩小，从而影响离子的运输，对中肠产生一定的麻痹作用。由于中肠是昆虫消化吸收营养的主要部位，这解释了神经毒素基因重组的杆状病毒能够有效减少试虫取食量并提高杀虫速度的原因。当然，神经毒素的作用靶标远不止中肠，要完全了解神经毒素对昆虫的全部作用途径与机理还有待进一步深入研究。

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Expression and activity of neurotoxin geneRjAa17finSf9 cells

MENG Jiao,YU Huan,ZHOU Bin,WANG Dun

(MinistryEducationKeyLaboratoryofPlantProtectionResources&PestManagement,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to expressRhopalurusjunceusneurotoxin gene inSpodopterafrugiperdacells (Sf9) to block insect sodium and potassium ion channels.【Method】 The toxic protein RjAa17f was expressed by baculovirus eukaryotic expression vector system,and western blots was used to identify the toxic protein.The change of midgut membrane potential caused by RjAa17f toxic protein crude extract was determined and the toxicity was tested.【Result】 By Western blot verification,RjAa17f target protein expressed inSf9 had the same size as predicted.After acting onHelicoverpaarmigeramidgut,the midgut membrane potential increased significantly during 3-12 h compared to CK and the trend decreased after 9 h.LD50of RjAa17f toxin protein crude extract was 108.12 μg/g.【Conclusion】 RjAa17f active protein was expressed inSf9,and it significantly changed midgut potential ofHelicoverpaarmigera.

Helicoverpaarmigera;neurotoxin geneRjAa17f;Sf9;toxic protein RjAa17f;baculovirus eukaryotic expression system

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.024

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.048.html

2015-05-15

国家自然科学基金项目(31170609，31270691)

孟 姣(1989-)，女，山西太原人，硕士，主要从事微生物资源与利用研究。E-mail：mengjiaomjmj@126.com

王 敦(1973-)，男，青海西宁人，教授，博士生导师，主要从事昆虫和病毒分子生物学研究。 E-mail:dunwang@foxmail.com;wanghande@nwsuaf.edu.cn

Q78

A

1671-9387(2016)11-0166-06