磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α在脂肪变性人肝癌HepG2细胞中的表达及其意义

孔怡琳 张玉佩 杨钦河 邓远军 陈妍凝 梁 曙 梁菊玲

(广东省中医院大学城医院放疗科，广东 广州 510632)



磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α在脂肪变性人肝癌HepG2细胞中的表达及其意义

孔怡琳 张玉佩1杨钦河1邓远军1陈妍凝1梁 曙1梁菊玲1

(广东省中医院大学城医院放疗科，广东 广州 510632)

目的 观察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α磷酸化在HepG2细胞脂变模型中的表达及意义。方法 HepG2细胞予油酸和棕榈酸组成的0.3 mmol/L游离脂肪酸(FFA)诱导24 h后，建立脂肪变性HepG2细胞模型，并设置对照组比较。诱导成功后，采用油红O染色观察细胞内脂滴蓄积状态；采用全自动生化仪检测细胞上清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量和细胞内甘油三酯(TG)含量；采用生物试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的变化，运用Western印迹法检测各组细胞AMPKα和磷酸化AMPKα(pAMPKα)蛋白的表达。结果 与对照组比较，模型组细胞内橘红色脂滴大量形成，且细胞内TG和MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD含量水平明显下降(P<0.01)，pAMPKα蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结论 FFA诱导的脂肪变性HepG2细胞模型可以出现脂质代谢紊乱和氧化应激状态，其机制可能与细胞内pAMPKα蛋白的激活减少有关。

脂肪变性；氧化应激；腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α被称为“能量感受器”，是真核细胞内与细胞能量代谢有关的蛋白激酶，与肿瘤和糖脂代谢紊乱型疾病等关系密切〔1，2〕。研究表明，AMPK可以感受细胞能量代谢的变化来调节脂肪酸和葡萄糖的代谢过程，并以磷酸化的形式抑制脂肪酸合成和增强线粒体对脂肪酸的利用和氧化〔3〕。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以无过量饮酒史和肝细胞弥漫性脂肪病变为主要特征，并体现遗传-环境-代谢应激特点的一类临床病理综合征。研究表明，AMPK/沉默调节因子1(SIRT1)通路参与了体内脂肪酸、葡萄糖的合成、代谢和输出，是NAFLD发病的关键环节之一〔4〕。国内外研究表明，人肝癌HepG2细胞与肝细胞在生物学特点和功能上存在相似性，油酸和棕榈酸等诱导剂都可以促使肝细胞和HepG2细胞发生脂肪变性，相比而言，HepG2细胞对脂毒性的耐受力更强，是脂肪变性细胞模型中最具优势和前景的备选细胞之一〔5，6〕。本研究通过游离脂肪酸(FFA)建立一种人肝癌HepG2细胞脂变模型，观察AMPK磷酸化(pAMPK)在脂肪变性HepG2细胞中的表达及其与脂质代谢、氧化应激的内在关系，以期从细胞水平探讨NAFLD的发病机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌HepG2细胞株由暨南大学医学院生化教研室馈赠；胎牛血清、DMEM高糖培养基和0.25%胰蛋白酶购自美国hyclone公司；油酸、棕榈酸和无游离脂肪酸牛血清白蛋白(FFA-free BSA)购自美国sigma公司；油红O染色试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所；兔抗鼠AMPKα多克隆抗体、兔抗鼠pAMPKα多克隆抗体、内参照GAPDH蛋白抗体购自美国Cell Signaling公司。7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)，倒置荧光显微镜(德国Leica公司)，JY96-Ⅱ型超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Tecan-safire2型全波长多功能酶标仪(奥地利TECAN公司)，蛋白垂直电泳及转印系统(美国Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞常规培养 HepG2细胞常规培养于含10%胎牛血清DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃，CO2浓度为5%。根据细胞生长情况，待细胞长至瓶壁80%～90%(约每2～3 d)，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞并传代。

1.2.2 脂肪变性HepG2细胞模型的诱导 参考Gómez-lechón等〔5〕方法并进行改进，将终浓度为2 mmol/L的油酸(C18∶1)和棕榈酸(C16∶0)，以2∶1的比例混合配制成储液，再将脂肪酸储液与FFA-free BSA混合，配制成结合BSA的脂肪酸。将处于对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁48 h后更换新鲜培养液，设立模型组和对照组，每组6复孔，将含0.3 mmol/L的FFA无血清DMEM培养基加入模型组培养孔中孵育细胞24 h，对照组为加入含1%FFA-free BSA无血清的DMEM培养基，孵育细胞24 h。

1.2.3 油红O染色观察细胞内脂质蓄积的程度 模型诱导成功后，吸弃各组细胞培养孔中的培养基，用PBS洗涤3遍，将6孔板中的细胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，油红O染液闭光染色20 min，60%异丙醇冲洗30 s，蒸馏水洗30 s至背景透明，OTC明胶封片，放置于显微镜下，采用Leica Qwin plus系统(普通光)拍照，观察各组细胞内脂质蓄积的程度。

1.2.4 全自动生化仪检测细胞上清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量变化 细胞诱导24 h成功后，将各培养孔中的细胞上清分别加进对应1.5 ml EP管中，样本送到暨南大学第一附属医院生化检验科，采用全自动生化仪检测细胞培养上清中ALT、AST含量变化。

1.2.5 全自动生化仪检测细胞内甘油三酯(TG)含量 取完各孔细胞上清后，将细胞用PBS洗涤2遍，加入0.25%胰酶消化细胞，用含10%胎牛血清DMEM培养基终止消化，并吹打细胞，确保将各孔内的所有细胞吹下，将各孔中的细胞悬液分别移入1.5 ml EP管中，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清；PBS洗涤细胞2遍，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清；将EP管置于冰上，每管各加入异丙醇300 μl；用超声细胞粉碎机裂解细胞3 min；细胞破碎后，离心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，样本送到暨南大学第一附属医院生化检验科，采用全自动生化仪检测上清中TG的含量。

1.2.6 生物试剂盒检测细胞内SOD、MDA的含量 按1.2.4方法处理细胞后，取细胞裂解液，采用SOD测定试剂盒(水溶性四唑盐法)和MDA测定试剂盒(硫代巴比妥酸法)，按照说明书检测细胞内SOD和MDA含量变化。

1.2.7 Western印迹法检测细胞AMPKα、pAMPKα蛋白表达水平 按1.2.4方法处理细胞后取适量细胞裂解液，使用前加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF终浓度为1 mmol/L。并对各组细胞进行计数，按照每6×106个细胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min离心5 min，根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。HepG2细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭和一抗孵育，并在4℃下过夜，然后洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，然后于暗室曝光，在X光片上显影，用Quantity One 软件对各条带的吸光度值进行分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 油红O染色观察各组细胞内脂质蓄积程度 对照组细胞轮廓及边缘清晰，体积较小，大部分细胞内无显著橘红色脂滴蓄积，偶见少数细胞内有少量橘红色脂滴，颜色较淡；模型组细胞胞膜轮廓及边缘模糊，体积明显肿大，细胞内可见较多橘红色脂滴，并出现脂滴融合的现象，部分脂滴甚至融合成链状或环状，见图1。

2.2 各组细胞AMPKα、pAMPKα蛋白表达水平 与对照组(AMPKα:0.93±0.15,pAMPKα:0.81±0.12)比较，模型组AMPKα总蛋白表达(0.77±0.09)轻度下调，差异无统计学意义(P>0.05)，而pAMPKα蛋白表达(0.37±0.1)显著下调(P<0.01)，见图2。

图1 油红O染色观察各组细胞内脂质蓄积程度(×200)

图2 各组细胞AMPKα 和 pAMPKα蛋白的表达

2.3 各组细胞上清ALT、AST含量变化 与对照组〔ALT(3.2±0.46)、AST(9.13±0.59)U/L〕比较，模型组诱导24 h后，细胞上清中的ALT〔(3.42±0.54)U/L〕、AST含量〔(10.57±2.19)U/L〕轻度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示采用0.3 mmol/L的FFA诱导HepG2细胞脂肪变性的方法，虽然会引起ALT、AST含量轻度上升，但对细胞的损伤程度有限。

2.4 各组细胞内TG含量的变化 与对照组〔(0.21±0.03)mmol/L〕比较，模型组HepG2细胞内TG含量〔(0.3±0.42)mmol/L〕明显增高(n=6，P<0.01)，提示FFA诱导HepG2细胞发生脂肪变性后会有大量的脂肪在细胞内蓄积。

2.5 各组细胞内SOD、MDA含量的变化 与对照组〔SOD(111.25±9.6)U/ngprot,MDA(13.04±2.68)nmol/mgprot〕比较，模型组细胞SOD含量〔(63.89±9.28)U/mgprot〕明显下降(P<0.01)，MDA含量〔(29.2±3.38)nmol/mgprot〕明显增高(P<0.01)。

3 讨 论

NAFLD在西方人群中发病率为20%～30%，在我国发病率为5%～24%，是仅次于病毒性肝炎的慢性肝病之一，且呈低龄化的发病趋势〔7～9〕，因此开展对NAFLD的防治研究具有重要的现实意义。体外脂肪变性细胞模型作为与NAFLD动物模型互补的研究载体，具有培养环境相对稳定、不受体内神经内分泌因素的干扰、实验条件易于控制和实验周期较短等有利优势，是研究NAFLD发病机制的重要技术平台。本实验以人肝癌HepG2细胞为研究对象，采用0.3 mmol/L的FFA无血清DMEM培养基诱导细胞建立脂肪变性HepG2细胞模型成功，该模型脂毒性较小，结合以往的研究成果分析，可能与细胞对高营养物质摄入增加，大量的FFA进入肝细胞内超过肝细胞的氧化能力，引起细胞脂质代谢障碍，TG的合成增多，TG的转运和氧化功能出现障碍所致〔10～12〕。目前阐释NAFLD发病进程的“二次打击”学说认为氧化应激、脂质过氧化、线粒体功能障碍及炎性细胞因子的释放等因素是单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎进展的关键因素，其进程可导致肝细胞膜损害，肝细胞发生脂肪变性、坏死、炎性浸润及活性氧(ROS)、MDA等代谢产物增多〔13〕。ROS不仅使细胞内抗氧化物质大量消耗，使微粒体脂质过氧化反应增强，导致氧化与抗氧化失衡，引起肝细胞损害加重，线粒体呼吸链功能下降，ATP合成障碍，还促使脂质过氧化产物MDA增多，而清除氧自由基的SOD大量减少〔14～16〕。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量高低反映了脂质过氧化的程度；SOD是高效的清道夫，可抑制氧自由基启动的脂质过氧化〔17〕。本研究结果提示脂质过氧化参与了细胞脂肪变性的过程，FFA诱导HepG2细胞发生脂肪变性24 h后，细胞内可以出现氧化应激的状态，其致病特点与NAFLD的发病机制存在相似性，是一种稳定、有效、更接近于NAFLD发病进程的体外细胞模型，为未来探索NAFLD的发病机制和筛选抗NAFLD药物提供了有利的技术平台。AMPK 在肝脏脂质稳态调节和能量平衡中发挥重要作用，其机制是通过对代谢酶的快速直接修饰(磷酸化)实现的，包括 AMPKα 亚单位的苏氨酸 172 位点发生磷酸化，AMPK 可以被激活为有活性的 pAMPK 形式，进而通过调节下游蛋白激酶或调控各种基因表达而影响机体的能量代谢〔18〕。研究表明，AMPK既可以下调固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)的表达抑制脂肪合成，又可以上调过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的表达促进脂肪分解，全面参与体内脂肪的合成和分解代谢〔19〕。本研究结果表明FFA诱导的脂肪变性HepG2细胞模型发生的脂质代谢紊乱和氧化应激状态，其机制可能与细胞内pAMPKα蛋白激活减少有关。由此可见，pAMPKα是参与机体脂质代谢调节的关键环节，pAMPKα可能成为防治NAFLD新的药物靶点。

1 程卫杰，程继东，荆绪斌.AMPK与消化系肿瘤的研究进展〔J〕.世界华人消化杂志，2012；20(4)：304-9.

2 胡淑国，宋光耀.腺苷酸活化蛋白激酶与胰岛素抵抗〔J〕.国际内科学杂志，2009；36(3)：137-40.

3 耿凤豪，张 鹏，董 玲，等.AMPK-能量代谢感受器与可激活AMPK相关的药物研究进展〔J〕.心脏杂志，2014；26(1)：97-100.

4 Yu Y，Zhang XH，Ebersole B，etal.Bitter melon extract attenuating hepatic steatosis may be mediated by FGF21 and AMPK/Sirt1 signaling in mice〔J〕.Sci Rep，2013；3：3142.

5 Gómez-lechón MJ，Donato MT，Martínez-romero A，etal.A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis〔J〕.Chem Biol Interact，2007；165(2)：106-16.

6 Cui W，Chen SL，Hu KQ.Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells〔J〕.Am J Transl Res，2010；2(1)：95-104.

7 Loomba R，Sanyal AJ.The global NAFLD epidemic〔J〕.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2013；10(11)：686-90.

8 Satapathy SK，Sanyal AJ.Epidemiology and natural history of nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Semin Liver Dis,2015；35(3)：221-35.

9 舒泳翔，吴鹏波，郭 芳，等.非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究进展 〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2015；24(8)：901-3.

10 Jump DB，Botolin D，Wang Y，etal.Fatty acid regulation of hepatic gene transcription〔J〕.J Nutr，2005；135(11)：2503-6.

11 Wang H，Kouri G，Wollheim CB..ER stress and SREBP-1 activation are implicated in beta-cell glucolipotoxicity〔J〕.J Cell Sci，2005；118(17)：3905-15.

12 刘 江，厉有名，陈韶华，等.一种实用的体外非酒精性脂肪肝细胞模型〔J〕.浙江大学学报(医学版)，2009；38(6)：626-9.

13 张玉佩，杨钦河，韩 莉，等.黄连素药性与脂肪肝证治关系初探〔J〕.中国中医基础医学杂志，2014；20(1)：115-9.

14 Wei Y，Rector RS，Thyfault JP，etal.Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction〔J〕.World J Gastroenterol，2008；14(2)：193-9.

15 Paradies G，Paradies V，Ruggiero FM，etal.Oxidative stress，cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(39)：14205-18.

16 Zhang S，Zheng L，Dong D，etal.Effects of flavonoids from Rosa laevigata Michx fruit against high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in rats〔J〕.Food Chem，2013；141(3)：2108-16.

17 巴图德力根，张 伟，韩志强，等.蒙药德都红花-7味散对高脂饮食诱导实验性脂肪肝大鼠血脂四项和SOD、MDA的影响〔J〕.世界华人消化杂志，2015；23(31)：5011-6.

18 冯 琴，孟胜喜，唐亚军，等.祛湿化瘀方通过调节AMPK 活性改善高脂饮食诱导的实验性脂肪肝肝脏脂肪代谢〔J〕.世界中医药，2015；10(2)：153-6.

19 Liao CC，Ou TT，Huang HP，etal.The inhibition of oleic acid induced hepatic lipogenesis and the promotion of lipolysis by caffeic acid via up-regulation of AMP-activated kinase〔J〕.J Sci Food Agric,2014；94(6)：1154-62.

〔2016-03-08修回〕

(编辑 李相军)

The expression and significance of AMPKα phosphorylation in the HepG2 cell model of steatosis

KONG Yi-Lin，ZHANG Yu-Pei，YANG Qin-He，et al.

Department of Radiology,University City Hospital of Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Objective To establish a steatotic HepG2 cell model induced by free fatty acid(FFA),and observe the expression and significance of adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase α(AMPKα)phosphorylation in HepG2 cells of steatosis.Methods Induced with DMEM medium of 0.3 mmol/L FFA(composed of oleic acid and palmitic acid)for 24 hours,the steatotic HepG2 cell model was successfully established(control group).After the cell models were successfully established,lipid droplets in cytoplasm were observed with Oil Red O staining,while the levels of alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST)in serum,and triglyceride (TG)accumulation in HepG2 cells were measured by automatic biochemical analyzer.The activities of superoxide dismutase(SOD)and malonyldialdehyde(MDA)were tested by biological reagent kit,while the protein expression of AMPKα and pAMPKα were analyzed by Western blot.Results Compared with those of control group,the levels of TG and MDA content were significantly higher (P<0.01),and lots of red lipid droplets inside cytoplasm were visible,while the expression of pAMPKα protein and SOD levels were significantly reduced (P<0.01)in model group.Conclusions The FFA-induced steatosis in HepG2 cells may result in lipid metabolism disorder and oxidative stress,possibly by activating the pAMPKα protein mildly in HepG2 cells.

Steatosis；Oxidative stress；AMPKα；Phosphorylation

国家自然科学基金资助项目(81302878)；广东省中医药局项目(20151224，20152112);广东省医学科研基金项目(A2015521)

张玉佩(1982-)，男，硕士，实验师，主要从事中西医结合防治慢性肝病及脂代谢疾病研究。

孔怡琳(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合防治肿瘤及慢性肝病的基础与临床研究。

Q493.5

A

1005-9202(2016)22-5496-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.002

1 暨南大学医学院