樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆与序列分析

熊 宏 ，陈海涛 ，宋 健 ，赵 平 ，刘小烛 ，丁 勇

（西南林业大学 a.生命科学学院；b.西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南 昆明 650224）

樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆与序列分析

熊 宏a，陈海涛a，宋 健a，赵 平b，刘小烛a，丁 勇b

（西南林业大学 a.生命科学学院；b.西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南 昆明 650224）

应用转录组测序分析和RT-PCR技术首次从樟叶越桔Vaccinium dunalianum中克隆了全长1 570 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1，其完整的开放阅读框推测编码由337个氨基酸残基组成的VdGAPDH1。VdGAPDH1理论相对分子量为36.57 kD，等电点为7.06，负电荷残基（Asp+Glu）总数为42个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为42个，不稳定系数为23.27，属稳定性蛋白质；其二级结构主要由随机卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角等构件组成。VdGAPDH1为无信号肽、无跨膜结构的亲水性蛋白质，推测其为NAD+-GAPDH的新成员，与已知细胞质型GAPDH之间存在高度保守性。VdGAPDH1包含2个保守超家族结构域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N为辅酶NAD+结合结构域，Gp_dh_C是行使糖运输和代谢的催化功能域。推测VdGAPDH1基因产物在樟叶越桔细胞质中参与糖酵解过程。该研究为后期VdGAPDH1基因的生理功能及其表达调控等研究奠定了基础。

樟叶越桔；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；基因克隆；糖酵解

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是生命活动中糖酵解、糖异生和卡尔文循环过程中的一种关键酶，是维持生命活动能量形成的最基本酶之一[1-4]。在细胞质中进行的糖酵解过程，GAPDH的作用是催化3-磷酸甘油醛氧化磷酸化形成1, 3-二磷酸甘油酸，从而产生糖酵解过程中的第一个ATP[5]。普遍认为GAPDH几乎在所有组织中都高水平表达，且通常在同种组织或细胞中的表达量相对恒定，因此其常被用作研究其他基因和蛋白表达的内参照[6]。目前研究推测GAPDH是一种多功能酶，除参与能量代谢外，在动物中还参与调节多种细胞的结构功能，如DNA修复、核RNA的输出、维持端粒结构、膜融合和转运、细胞骨架动态平衡和加速微管蛋白成束等[7-12]，以及在植物逆境胁迫下发挥重要作用[13-16]。

樟叶越桔Vaccinium dunalianumWight为杜鹃花科Ericaceae越桔属Vaccinium常绿灌木或小乔木，该植物具有多方面的生理活性，植株全株可做药用，有祛风除湿、舒筋活络等功效[17]。Zhao等[18]研究发现云南省武定县野生樟叶越桔是一种富含皮肤美白天然活性剂原料熊果苷（arbutin）及其衍生物的特殊资源植物，暗示樟叶越桔具有极大的研究和应用价值。随后，有关樟叶越桔的系统进化[19]、化学成分[20-21]、核酸提取[22]、组织培养[23]、重要功能基因克隆[24-25]等方面的研究相继被报道，但目前尚未见有关于樟叶越桔GAPDH基因方面的研究报道。本研究根据前期樟叶越桔叶芽转录组测序实验数据拼接得到的GAPDH基因cDNA全长序列设计特异性引物，结合RT-PCR技术克隆了樟叶越桔VdGAPDH1基因全长cDNA序列，并对其编码产物VdGAPDH1蛋白特性进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验材料

实验材料为樟叶越桔叶芽，采自云南省楚雄州武定县高桥镇唐家村（海拔高度为2 100 m，位于 25°57′N、102°24′E），原植物标本存放于中国科学院昆明植物研究所标本馆，由刘恩德博士鉴定。取樟叶越桔新鲜叶芽置于液氮中速冻，带回实验室后于-80℃冰箱中保存，供提取总RNA用。

1.1.2 实验试剂

植物总RNA提取试剂盒购于OMEGA公司，反转录试剂盒和pMD19-T载体和大肠杆菌JM109感受态细胞购于宝生物工程有限公司，DNA胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，其他相关试剂均购于昆明滇工科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取与检测

参照朱东阳等[22]方法提取樟叶越桔叶芽总RNA，分别用紫外分光光度计法和1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA样品的纯度和完整性。

1.2.2 樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆

根据本课题组前期对樟叶越桔叶芽转录组测序、拼接、分析获得的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA全长序列设计特异性引物，包括Sense Primer：5'-CAATCGTCGCTTTAGTTCCA-3'和Anti-sense Primer：5'-TAAATGAGTCCGAGCACAGG-3'，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。第一链cDNA合成按照RNA反转录试剂盒说明书进行操作。取反转录cDNA模板2 μL，SensePrimer和 Anti-sense Primer各 1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立 25 μL的PCR反应体系。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物检测、回收、T/A克隆与测序

PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测，回收目的片段并连接到pMD19-T载体上，将重组子转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化复苏后的菌液涂布在含有Amp、IPTG和X-Gal的LB固体培养基上，过夜培养后随机筛选白色菌落，将阳性克隆菌液送往上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。

1.2.4 生物信息学分析

应用NCBI的Blast工具对核酸和蛋白质序列进行相似性比对，使用ORF Finder工具分析基因mRNA的开放阅读框；参照已知文献[24-25]报道的生物信息学方法分析蛋白理论分子量、等电点、氨基酸含量和稳定性，比对同源蛋白质序列，构建系统发生树，并对蛋白质亲水/疏水性特性、跨膜结构、信号肽及功能域进行预测；目的蛋白二级、三级结构预测参照丁勇等[26]应用的方法进行。

2 结果与分析

2.1 樟叶越桔叶芽总RNA提取与检测

本实验获得的樟叶越桔叶芽总RNA琼脂糖凝胶电泳结果（见图1）显示28S、18S和5.8S rRNA条带清晰，点样孔无亮斑，无弥散拖尾，28S rRNA条带亮度约为18S rRNA的2倍，说明总RNA完整性好且无污染；总RNA的A260/A280值为2.03，说明纯度好且无蛋白质、多糖和酚类物质等杂质污染。表明本实验提取获得的总RNA能满足后续分子实验要求。

图1 樟叶越桔叶芽总RNA的琼脂糖凝胶电泳图像Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of the total RNA from Vaccinium dunalianumbuds

2.2 樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆

以提取的总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，利用前述引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳图（见图2）显示PCR产物条带单一，该特异性PCR产物条带经胶回收和TA克隆测序，得到樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA，序列长1 570 bp，与前期转录组测序拼接结果一致，命名为VdGAPDH1。应用NCBI中的BlastN同源性比对分析结果显示，樟叶越桔VdGAPDH1基因与 田 七Panax notoginseng（KF815711.1）、人 参Panax ginseng（KF699323.1） 的GAPDH基因的相似性为85%，与大豆Glycine max（NM_001250615.1）、 杨 树Populus（XM_002298558.2）、 棉 花Gossypium hirsutum（FJ415206.1）、川桑Morus notabilis（XM_010106872.1）、豌豆Pea（L07500.1）、烟草Nicotiana tabacum（AJ133422.1）、可可Theobroma cacao（XM_007037842.1） 和 菜 豆Phaseolus vulgaris（KF033722.1）等的GAPDH基因的相似性为84%，表明该实验成功获得樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA序列。

图2 樟叶越桔VdGAPDH1基因RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图像Fig.2 Agrose gel electrophoresis analysis of RT-PCR product of VdGAPDH1 gene

2.3 序列分析

NCBI的ORF Finder工具分析结果显示本实验克隆的VdGAPDH1基因cDNA序列在50～1 063 bp区为完整的ORF区域，1～49 bp区属于5'非编码区，1 064～1 570 bp区属于3'非编码区。推测克隆的VdGAPDH1基因编码由337个氨基酸残基组成的樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（VdGAPDH1），蛋白质理化性质预测结果显示，VdGAPDH1分别含负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）和正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数各42个，等电点pI值预测为7.06，理论相对分子量为36.57 kD，不稳定系数为23.27，推测VdGAPDH1属于稳定性蛋白质。图3显示了VdGAPDH1基因ORF的核苷酸序列及其推导的VdGAPDH1蛋白的氨基酸序列。

蛋白质同源性分析结果（见图4）显示VdGAPDH1与巨桉Eucalyptus grandis（EgGAPDH，XP_010026741.1）、 荷 花Nelumbo nucifera（NnGAPDH，XP_010248875.1）、 梅 花Prunus persica（PpGAPDH，XP_007222474.1）、芝 麻Sesamum indicum（SiGAPDH，XP_011086733.1）、甜橙Citrus sinensis（CsGAPDH，XP_006484037.1）、 丹 参Salvia miltiorrhiza（SmGAPDH，AGW24628.1）、 蓖 麻Ricinuscommunis（RcGAPDH，XP_002511235.1）、三七Panax notoginseng（PnGAPDH，AIX10772.1）、金 鱼 草Antirrhinum majus（AmGAPDH，P25861.1）等的GAPDH相似性都高达93%以上，与其它许多植物的GAPDH蛋白相似性也高达90%。用不同物种GAPDH基因编码的氨基酸序列构建系统进化树，结果（见图5）显示VdGAPDH1虽然独自处在一个分支，但是它与比较的其它12个物种GAPDH的进化关系却十分近，说明不同物种的GAPDH同源基因在进化过程中高度保守。

图3 VdGAPDH1 ORF核苷酸序列及其推导的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 ORF

图4 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的氨基酸序列比对Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 and GAPDH gene from other plants

图5 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的进化树分析Fig.5 Phylogenetic analysis of VdGAPDH1 and other plant GAPDH

分泌性蛋白在N-末端存在一段16至26个氨基酸残基组成的特殊序列，称为信号肽，其具有指导初生蛋白质的跨膜转移及其定位功能，在行使功能后被切除[27]。VdGAPDH1蛋白信号肽分析结果（见图6）显示其存在信号肽的可能性值为0.001、信号锚定的可能性值为0，N-末端氨基酸残基信号肽剪切值为0，表明VdGAPDH1蛋白不可能存在信号肽。结合蛋白理化性质分析结果，推测VdGAPDH1为非分泌性的稳定性蛋白质。

蛋白质疏水性和跨膜结构域分析结果能为蛋白质二级结构预测、结构域和功能域的划分提供参考依据[24]。亲水/疏水性分析结果（见图7）显示VdGAPDH1整个肽链中均匀分布着亲水性氨基酸，且在第142～143位氨基酸残基出出现亲水性最强值（-2.322），虽在第330位氨基酸残基处出现了疏水性最强值（2.278），但VdGAPDH1整个肽链中没有出现明显的疏水区域，表明VdGAPDH1属于亲水性蛋白。跨膜结构域预测结果（见图8）显示VdGAPDH1也不存在蛋白质跨膜结构域，表明也不存在疏水性结构域，与疏水性分析结果相符合。提示VdGAPDH1在樟叶越桔中以非分泌性稳定性蛋白质存在，其在细胞质核糖体中合成后不经运转且不与细胞膜结合而在细胞质中行使功能。

图6 VdGAPDH1蛋白信号肽预测Fig.6 Prediction of VdGAPDH1protein signal peptide

蛋白质分子的多肽链通常折叠和盘曲成比较稳定的空间结构，形成比较稳定的二级结构，进一步才能完成活性功能域构象的构建，形成高级结构，最终完成特定的生命活动。VdGAPDH1蛋白质二级结构预测结果（见图9）显示其由30.27%的随机卷曲、29.97%的延伸链、26.11%的α-螺旋和13.65%的β-转角等构件组成。蛋白质结构功能域分析结果（见图10）表明VdGAPDH1包含2个保守结构域，分别为位于第4～154位氨基酸残基的Gp_dh_N超家族结构域和位于第159～316位氨基酸残基处的Gp_dh_C超家族结构域，这符合已知GAPDH的结构和功能特征，其每个亚基包含两个保守结构域，即辅酶结合结构域和催化结构域。

图7 VdGAPDH1蛋白质疏水性和亲水性分析Fig.7 Prediction of VdGAPDH1protein hydrophobicity and hydrophilicity pro fi le

图8 VdGAPDH1跨膜结构域预测Fig.8 Prediction of transmembrane region of VdGAPDH1

图9 VdGAPDH1蛋白氨基酸序列的二级结构预测Fig.9 The secondary structure of the deduced VdGAPDH1 polypeptide

图10 VdGAPDH1蛋白保守区分析Fig.10 Analysis of VdGAPDH1protein conservative region

图11 樟叶越桔VdGAPDH1蛋白质三维结构预测图像Fig.11 3D structure prediction of VdGAPDH1 protein

I-TASSER程序预测VdGAPDH1蛋白三级结构图（见图11-A）中可以明显显示出Gp_dh_N和Gp_dh_C两个保守结构域，SWISS-MODEL同源建模法构建了樟叶越桔高级结构模型，显示VdGAPDH1以同源四聚体的形式存在，与水稻Oryza Sativa细胞质型GAPDH同源四聚体模型3e5r.1.A具有85.71%的同源性，与水稻Oryza Sativa细胞质型GAPDH同源四聚体模型3e6a.1.D和3e6a.1.C也同时具有85.67%的同源性。推测VdGAPDH1属于细胞质的NAD+-GAPDH，并类似于水稻细胞质型GAPDH在生物体中以同源四聚体的形式发挥生物学功能。

3 讨 论

GAPDH存在于所有生物体中，是维持生命活动能量形成的最基本酶之一[1-4]。GAPDH的基因和蛋白已在谷子Setaria italica[28]、小麦Triticeae Dumort[29]、 家 蚕Bombyx mori[30]、 球毛壳菌Chaetomium globosum[31]等物种中得到了一定的研究。本研究首次从樟叶越桔中克隆了GAPDH基因长1 570 bp的cDNA序列，命名为VdGAPDH1。推测VdGAPDH1在樟叶越桔中编码由337个氨基酸残基组成的36.57 kD的VdGAPDH1。蛋白质一致性分析结果显示VdGAPDH1与巨桉Eucalyptus grandis、荷花Nelumbo nucifera和梅花Prunus persica等多数已知植物的GAPDH都具有非常高的相似性，与已知研究观点相一致[1-4]，表明GAPDH在不同生物中具有高度保守性。蛋白质结构功能分析结果显示VdGAPDH1的第4～154位氨基酸残基与Gp_dh_N超家族高度同源，而其第159～316位氨基酸残基与Gp_dh_C超家族高度同源，表明VdGAPDH1在功能结构上符合已知GAPDH的结构和功能特征，包含2个保守超家族结构域Gp_dh_N和Gp_dh_C，这两个保守结构域在VdGAPDH1蛋白三维结构图中能清晰显示出来。推测VdGAPDH1的Gp_dh_N保守结构域为辅酶结合结构域，Gp_dh_C保守结构域为催化结构域。

目前研究已证实，GAPDH以两种不同类型存在高等植物中，一种是NAD+-GAPDH，存在于细胞质基质中，由4个相同的GapC亚基组成，特异性结合NAD+后在糖酵解过程中发挥作用；另一种是NADP+-GAPDH，存在于细胞叶绿体中，由GapA和GapB两个不同亚基组成，特异性结合NADP+后在卡尔文循环中发挥作用[32,33]。本研究克隆的VdGAPDH1基因推测编码由337个氨基酸残基组成的VdGAPDH1为无信号肽、无跨膜结构的亲水性蛋白质，且与已知细胞质型GAPDH具有非常高的同源性，推测VdGAPDH1为NAD+-GAPDH的新成员。该推测同时符合罗聪等[34]的研究结果，认为由337～340个氨基酸残基组成的GAPDH存在于细胞质中主要参与糖酵解过程。

有研究认为GAPDH在同一生物体内不同组织中均高量而稳定表达，因此可作为内参基因来研究其他功能基因的表达水平[6]。来自不同植物的GapC基因和蛋白质序列高度保守，因此又可作为植物起源与进化的分子标准[35]。也有研究认为GAPDH是一个多功能的酶，除参与能量代谢外，在动物中还参与DNA修复、核RNA的输出、膜融合和转运等多种细胞的结构功能[7-12]，以及在植物光合作用和逆境胁迫下发挥重要作用[13-16,36]，GAPDH基因表达和蛋白质翻译水平会随着内外源诱导因子变化而变化。然而VdGAPDH1基因在樟叶越桔中表达是否稳定、是否可以作为内参用于研究其他功能基因的表达量有待于进一步的研究。

4 结 论

本研究首次从樟叶越桔中克隆了全长1 570bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因mRNA序列，命名为VdGAPDH1。推测VdGAPDH1基因在樟叶越桔中编码由337个氨基酸残基组成的36.57 kD的VdGAPDH1。VdGAPDH1为无信号肽、无跨膜结构、亲水性的稳定蛋白质，且与已知细胞质型GAPDH具有高度同源性，推测其为NAD+-GAPDH的新成员。VdGAPDH1包含2个保守超家族结构域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N保守结构域为辅酶NAD+结合结构域，Gp_dh_C保守结构域是行使糖运输和代谢的催化功能域。推测VdGAPDH1基因产物在樟叶越桔细胞质中参与糖酵解过程。该研究为对VdGAPDH1基因的生理功能及其表达调控等进行深入研究奠定了基础。

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Cloning and bioinformatics analysis ofVdGAPDH1gene inVaccinium dunalianum

XIONG Honga, CHEN Hai-taoa, SONG Jiana, ZHAO Pingb, LIU Xiao-zhua, DING Yongb
(a.College of Life Sciences; b.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In this study, the geneVdGAPDH1with a full-length cDNA comprised 1570 nucleotides was primordial obtained by transcriptome sequencing and RT-PCR amplification fromV.dunalianum.The open reading frame encoded a putative VdGAPDH1 comprising 337 amino acid residues with molecular weight of 36.57 kD and isoelectric point of 7.06.The total number of positively charged residues (Arg+Lys) was 42, and the total number of negatively charged residues (Asp+Glu) was also 42.VdGAPDH1 with unstable coef fi cient 23.27 belongs to the stable protein.The main parts of predicted secondary structures of VdGAPDH1 were α-helices,random coils and extended strand.It was predictive VdGAPDH1 belongs to hydrophilic protein without any signal peptide and transmembrane structure.VdGAPDH1 was considered to be a new number of NAD+-GAPDH super family proteins.VdGAPDH1 shares with highly conservation in sequences with cytoplasmic GAPDH in many plants.There are two conserved super family structures,named as Gp_dh_N and Gp_dh_C in the structure of VdGAPDH1 protein.Homology modeling of the GAPDH inB.gymnorrhizabased on the 3D structure of the one in Spinaciaoleracea con fi rmed that the polypeptides between 70th to 405th amino acids was highly conserved.Plays a very important role in sugar metabolism and energy metabolism.TheVdGAPDH1gene product consists of two super family structures Gp_dh_N with function combining and Gp_dh_C, This work also suggested that VdGAPDH1 involve in process of glycolysis in the cytoplasm inV.dunalianum.The study results established the foundation for the expression, regulation and functional analysis ofVdGAPDH1.

Vaccinium dunalianum; GAPDH; gene cloning; glycolysis

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.004

http: //qks.csuft.edu.cn

S718.46

A

1673-923X(2016)07-0017-08

2015-10-14

国家自然科学基金项目（21462040, 31460076）；云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目（50097505）

熊 宏，硕士研究生

丁 勇，高级实验师，硕士生导师；E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

熊 宏，陈海涛，宋 健，等.樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆与序列分析[J].中南林业科技大学学报，2016, 36(7): 17-24, 30.

[本文编校：吴 毅]