赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性

陈开健，王静安，刘巧林，王荣华，徐莹，赵鑫，肖调义*

(1.湖南农业大学湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000)

赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性

陈开健1,2，王静安1#，刘巧林1,2，王荣华1，徐莹1，赵鑫1，肖调义1,2*

(1.湖南农业大学湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000)

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性，采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp)，其中包含5′端非编码区50 bp，开放阅读框1 629 bp，3′端非编码区942 bp；该基因编码542个氨基酸，推导的蛋白质相对分子质量为61 670，理论等电点为6.01。SMART结构分析结果显示，TRAF6基因编码的蛋白包含1个RING结构域、2个锌指结构域、1个螺旋卷曲结构域和1个MATH结构域。系统进化树分析结果表明，赤眼鳟TRAF6与团头鲂TRAF6的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示，TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达，其中在肝脏中的表达量最高，在中肠中的表达量最低；经GCRV感染后，赤眼鳟脾脏和头肾中TRAF6均呈波动上调趋势，在24 h达到峰值，表明TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应。

赤眼鳟；肿瘤坏死因子受体相关因子6基因；草鱼呼肠孤病毒(GCRV)

投稿网址：http：//xb.ijournal.cnAbstract： In order to investigate whether tumor necrosis factor-associated factor 6 gene involved inantiviral immune response, the full-length cDNA of TRAF6 in Squaliobarbus curriculus was cloned by using RACE–PCRs method. The full-length cDNA of TRAF6 is 2 621 bp including a 5′–terminal untranslated region of 50 bp, a 3′–terminal untranslated region of 942 bp and an open reading frame of 1 629 bp encoding a polypeptide of 542 amino acid residues. The putative isoelectric point and molecular weight of TRAF6 was 6.01 and 61 670, respectively. The protein encoded by this gene includes one ring domain, two zinc fingers, one coiled-coil region, and one MATH domain. Phylogenetic analysis showed that the TRAF6was the most homogeneous to Megalobrama amblycephala. The expression of TRAF6could be detected in all the 12 tested tissues by RT–PCR, which the highest expressed in the liver and the lowest expressed in midgut.After injection with grass carp reovirus (GCRV), the TRAF6expression level was up and down regulated in both spleen and head kidney, and reached the peak at 24 h, respectively. The results suggest that TRAF6 gene might play important roles in the immune response of Squaliobarbus curriculus against GCRV.

Keywords：Squaliobarbus curriculus; tumor necrosis factor receptor–associated factor 6 gene (TRAF6); grass carp reovirus(GCRV)

Toll样受体(toll–like receptor, TLR)可通过识别病原的相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)与下游的不同受体接头蛋白结合，激活细胞内的信号转导途径，在先天性免疫应答和获得性免疫应答反应中起重要作用[1]。肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptorassociated factors 6, TRAF6)是TRAFs家族中唯一既与肿瘤坏死因子(TNF)超家族又与白细胞介素–1受体/Toll样受体(IL–1/TLR)超家族密切相关的重要接头分子，介导多条信号转导通路[2]。在TLRs介导的信号转导途径中，TRAF6参与MyD88依赖途径和TRIF信号转导途径，是激活NF–κB通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的交叉点[3]。TRAF6基因是在1996年Ishida等[4]研究酵母双杂交系统对CD40信号转导的影响时发现的，目前，TRAF6基因已在多种物种中被克隆出来，其中已报道存在TRAF6基因的鱼类有大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[5]、斑马鱼(Danio rerio)[6]、鲤鱼(Cyprinus carpio)[7]、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)[8]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)[9]、团头鲂(Megalobramaambly cephala)[10]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[11]等。研究表明，TRAF6基因在鱼类抗细菌、病毒和寄生虫的免疫反应中发挥了重要作用，团头鲂[10]、东北林蛙[12]等在嗜水气单胞菌胁迫下TRAF6的表达量上调；草鱼[9]在多子小瓜虫感染后TRAF6的表达量上调；斑马鱼[6]在感染乌鳢杆状病毒后TRAF6的表达量上调。TRAF6也可作为泛素连接酶(E3)与泛素结合酶(E2) Ubc13/Uev1A结合，形成多聚泛素链而起连接作用[13]，与适应性免疫和固有免疫、炎性反应、骨代谢、胚胎发育和组织发育等密切相关[14–15]，参与多种疾病的免疫调控，有望成为相关疾病的治疗靶点。

赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)作为淡水养殖主要的优质经济鱼类之一，对环境具有较强的适应性和抗病力。赤眼鳟抗草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的能力优于草鱼[16–17]。赤眼鳟Mx、MyD88、TLR3等抗GCRV的相关基因已被成功克隆，这些基因均参与了赤眼鳟抗GCRV病毒的免疫反应[18–20]。为探究TRAF6基因是否参与了赤眼鳟抗GCRV病毒免疫反应，本试验中克隆赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长，开展生物信息学分析，检测TRAF6在赤眼鳟不同组织中的分布，研究赤眼鳟在感染GCRV后其TRAF6基因在脾脏和头肾等组织中的表达特性，旨在为进一步研究鱼类TRAF6在TLRs信号通路中的抗病毒免疫机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

赤眼鳟(6月龄)取自湖南农业大学水产基地，平均体质量为(90±10) g。试验前挑选健康赤眼鳟作为试验材料，置于室内循环水养殖系统中暂养1个月，水温控制在(28±1) ℃，每天定时光照12 h，并按鱼体质量的1%投喂普通草鱼饲料。试验用GCRV病毒由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员提供。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成

取50～80 mg赤眼鳟脾脏组织，按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction (TaKaRa, China)试剂盒说明书提取总RNA，其RNA质量和浓度采用BioSpectrometer Basic核酸蛋白仪(Eppendorf, 德国)检测，完整性用1%琼脂糖凝胶电泳检测；按照SMARTer®RACE 5′/3′cDNA Kit Components(Clontech)试剂盒说明书合成5′–RACE Ready cDNA和3′–RACE Ready cDNA。

1.2.2 赤眼鳟TRAF6基因全长cDNA的克隆

根据GenBank中已提交的鱼类TRAF6序列，利用Primer Premier 6.0软件设计引物TRAF6–3′和TRAF6–5′，以上述cDNA为模板进行3′和5′目的片段扩增。所有引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。按照SMARTer® RACE5′/3′Kit用户手册进行3′–RACE和5′–RACE的PCR。PCR产物切胶回收后克隆至pMD19–T载体(TaKaRa, China)，转染至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆菌落送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

表1 本研究中所用引物的序列Table 1 Primer sequences in the research

1.2.3 赤眼鳟TRAF6序列的生物信息学分析

用SeqMan 7.1软件拼接TRAF6基因全长cDNA序列；用ExPASy–Translate tool预测开放阅读框；用ExPASy–Compute pI/Mw tool计算相对分子质量和等电点；用BLAST进行序列相似性比较；用SMART进行蛋白质结构域预测；用MEGA 5.1软件邻接法构建系统进化树。

1.2.4 赤眼鳟TRAF6的组织表达分析

随机选取3尾健康赤眼鳟，分别取其脾、肝、肾、前肠、中肠、后肠、头肾、脑、鳃、鳍条、肌肉和皮肤共12个组织混样，提取总RNA，以Oligo (dT)18为引物，按照RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis kit(Fermentas，美国)逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，选用β-actin基因作为内参基因，设计内参引物β–actin–RTF/RTR和特异性荧光定量引物TRAF6–RTF/RTR扩增TRAF6片段(表1)。使用SYBR Green I染液在CFX96荧光定量PCR仪 (Bio–Rad，USA)上进行荧光定量检测。反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环。溶解曲线温度从65℃升至95 ℃，每5 s增加0.5 ℃。数据处理使用CFX manager software 3.1(Bio–Rad，美国)，用法分析其相对表达值，作图软件使用GraphPad Prism 6。

1.2.5 GCRV感染后TRAF6在免疫组织中的表达特征分析

将180尾健康赤眼鳟随机分成6组。设置实验组和对照组，对照组每尾鱼注射0.2 mL磷酸缓冲液(PBS)，实验组每尾鱼注射0.2 mL GCRV病毒液。GCRV感染后0、6、12、24、48、72、96、120、144 h每组随机选取3尾鱼，取其脾脏和头肾组织样提取总RNA，合成第一链cDNA，并按上述步骤进行实时荧光定量PCR。

2 结果与分析

2.1 赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长

赤眼鳟TRAF6基因cDNA全长为2 621 bp(GeneBank登录号为KU365989)，包含50 bp的5′非编码区，942 bp的3′端非编码区和1 629 bp的开放阅读框，编码542个氨基酸，3′端非编码区无终止信号，含有6个attta不稳定基序，并存在典型的poly(A)尾。该基因预测的蛋白质相对分子质量为61 670，理论等电点为6.01。SMART蛋白质序列分析结果(图1)显示，TRAF6基因编码的蛋白具有4个结构域：RING结构域(71～109个氨基酸)，锌指结构域(共2个，分别为152～204、205～262个氨基酸)，螺旋卷曲结构域(311～374个氨基酸)和MATH结构域(379～503个氨基酸)。

图1 赤眼鳟TRAF6结构域预测结果Fig.1 Schematic diagram for structure prediction of TRAF6

2.2 赤眼鳟TRAF6的系统进化分析

氨基酸相似性比较结果(表2)显示，赤眼鳟TRAF6氨基酸序列与团头鲂的相似性最高为98%，与草鱼、鲤鱼、斑马鱼和鲫鱼等鲤科鱼类的相似性均达90%以上，与其他鱼类的相似性为61%～71%，与鸟类和哺乳动物的相似性为58%～59%。系统进化树分析结果显示，整个系统分2大支，鱼类单独聚为一支，两栖类、鸟类和哺乳动物聚为另一支；赤眼鳟、团头鲂和草鱼聚为一簇后，和其他鲤科鱼类聚为一大簇(图2)。

表2 赤眼鳟TRAF6氨基酸序列与其他物种的相似性Table 2 Percentage identities in amino acid sequence of TRAF6 with other species

图2 赤眼鳟TRAF6氨基酸序列的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic relationship of fish TRAF6 proteins

2.3 不同组织中TRAF6的相对表达量

实时荧光定量PCR结果显示， TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达，但表达量存在明显差异，其中在肝脏中的表达量最高，在脑和鳃中的表达量次之，在其余组织中均有不同程度的表达，在中肠中的表达量最低(图3)。

图3 不同组织中TRAF6的相对表达量Fig.3 Relative expression of TRAF6 in different tissues

2.4 GCRV感染后TRAF6的表达特性

GCRV感染后，TRAF6在赤眼鳟免疫组织脾脏和头肾中不同时间的表达趋势基本相同：感染初期(感染后0～6 h)，TRAF6的表达量上调；感染后12 h时出现下调，感染后24 h再次显著上调，出现峰值；感染后48 h又出现下调；感染后96 h上调，且维持在较高水平，感染后144 h恢复至正常水平，即GCRV感染后，TRAF6在赤眼鳟免疫组织中的表达量呈波动上调趋势，在感染后24 h达到峰值(图4，图5)。

图4 GCRV感染后TRAF6在脾脏中的表达水平Fig.4 Expression analysis of TRAF6 in spleen after challenged with GCRV

图5 GCRV感染后TRAF6在头肾中的表达水平Fig.5 Expression analysis of TRAF6 in head kidney after challenged with GCRV

3 讨论与结论

本试验中克隆获得了TRAF6基因的cDNA全长，共编码542个氨基酸。该基因氨基酸序列不仅在鱼类中高度保守，在鸟类和哺乳动物中均具有TRAFs家族基因的4个典型结构域，其N端的RING结构域和锌指结构域对于下游信号通路(NF–κB或JNK)的激活具有重要作用[21]；RZ(RING and zinc finger)能够与MATH结构域相互作用并介导TRAF6的泛素化[22]；螺旋卷曲结构域是TRAF6泛素化和NF–κB信号通路活化所必需的[23]。

不同物种的TRAF6在不同组织中的表达量存在差异。本研究中TRAF6在已检测的赤眼鳟组织中均有不同程度的表达，且在肝脏中的表达量最高，而半滑舌鳎的TRAF6基因在鳃中的表达量最高[11]，大黄鱼的在脾脏中的表达量最高[5]，草鱼的在头肾中的表达量最高[9]。TRAF6在不同鱼类中的表达模式存在差异，但均与免疫发生的组织或器官密切相关，据此可推测TRAF6可能在鱼类的免疫应答中发挥了重要作用。

本研究中赤眼鳟在感染GCRV后，其头肾和脾脏中TRAF6的表达呈现出波动上调趋势。这可能与TRAF6参与多条信号转导途径(TRIF依赖性途径和MyD88依赖性途径)有关。TRAF6作为TLRs信号转导通路的重要接头分子，它的上调表达会激活IRAK1/2、TAK1、IRF7等一系列上、下游因子[2]，但鱼类的免疫信号通路较为复杂，赤眼鳟TRAF6在应对GCRV抗病毒免疫反应中的调控方式有待研究。

本研究结果表明，赤眼鳟TRAF6主要由RING结构域、锌指结构域、螺旋卷曲结构域和MATH结构域组成，具有TRAFs家族的典型结构特征，在健康赤眼鳟组织中的表达差异明显；GCRV攻毒后，TRAF6在赤眼鳟脾脏和头肾中的表达量上调。这些结果提示TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应，但其作用机制还有待研究。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Molecular cloning and expression characteristics response to GCRV of TRAF6 in Squaliobarbus curriculus

Chen Kaijian1,2, Wang Jing′an1#, Liu Qiaolin1,2, Wang Ronghua1, Xu Ying1, Zhao Xin1, Xiao Tiaoyi1,2*
(1.Hunan Engineering Research Center for Utilization of Characteristics of Aquatic Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Changde, Hunan 415000, China)

Q785; S965

A

1007-1032(2016)06-0641-06

2016–10–20

2016–11–01

国家自然科学基金青年项目(31402289)；国家自然科学基金项目(31272652；31572615)

陈开健(1971—)，男，湖南永州人，博士，副教授，主要从事水生动物遗传育种研究，chenkaijian2002@aliyun.com；#共同第一作者，王静安(1993—)，女，浙江台州人，硕士研究生，主要从事水生动物遗传育种研究，409626183@qq.com；*通信作者，肖调义，博士，教授，主要从事水生动物遗传育种研究，tyxiao1128@163.com