类风湿关节炎基因治疗的研究进展

李静++叶志中++尹志华++陈新鹏

【摘 要】 目前类风湿关节炎的发病机制尚不清楚。随着对类风湿关节炎的深入研究，近年来多种生物制剂的临床治疗获得了成功；但生物制剂花费较高且易感染，而基因治疗能够克服这些缺点。基因治疗主要包括靶基因的选择、动物模型的实验研究以及临床试验的研究等。靶基因的选择中，主要阐述了调控细胞因子的相关基因、核转录因子-κB抑制剂以及调控细胞凋亡的相关基因。虽然类风湿关节炎的基因治疗目前处于探索阶段；但现有的临床研究表明基因治疗有显著的疗效，进一步说明类风湿关节炎的基因治疗有较好的研究前景。

【关键词】 关节炎，类风湿；基因治疗；靶基因；综述

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性的累及外周关节的持续性滑膜炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病，主要特点是滑膜炎症导致血管翳的形成、软骨破坏及骨质侵蚀，而最终影响关节的完整性。RA的发病机制尚不完全清楚，传统的药物治疗能够有效控制疾病的进展；但是存在起效慢以及不良反应多等缺点。目前，生物制剂已经广泛应用于临床，然而仍有一部分患者应用生物制剂效果并不明显。生物制剂的主要缺点是限制免疫系统的功能，导致机体更容易感染。而基因治疗避免了这些缺点，基因治疗的主要思路是将具有编码治疗性蛋白的基因导入特定的组织中，使患者能够持续性地产生这种治疗性蛋白，这给RA的治疗开辟了新路径。

1 基因治疗的一般过程

基因治疗能够潜在地治疗疾病的遗传性，主要方法是在靶细胞内通过抵消或者替换某些缺陷基因，从而达到治疗该缺陷基因引起某种疾病的目的[1]。

基因治疗的过程主要包括4个阶段。（1）目的基因的获取，常用的方法有：①通过限制性内切酶在生物体基因上直接提取目的基因；②采用逆转录酶，以mRNA为模板合成单链DNA，再经DNA聚合酶作用产生双链DNA；③根据已知的氨基酸人工合成DNA；④用PCR扩增特定片段。（2）载

体的选择，主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统除了常用的腺病毒、逆转录病毒之外，还包括慢病毒、疱疹病毒、麻疹病毒及杆状病毒等。（3）重组DNA的构建，即用DNA连接酶将目的基因DNA分子与载体连接，形成一个具有自我复制能力的杂合子DNA。（4）重组DNA导入体细胞。

人类的疾病主要分为单基因遗传病、多基因遗传病以及获得性基因遗传病。RA的发病机制仍不清楚，目前研究表明，RA可能是复杂的多基因遗传病，与多个尚未阐明的易感基因以及环境因素之间的相互联系有关[2]。尽管RA的遗传性并不符合传统意义上的孟德尔定律，但是基因治疗同样可用于RA患者的治疗[3]。

2 RA的基因治疗

2.1 细胞因子的基因治疗 目前基因治疗研究较多的是与细胞因子有关的靶基因。细胞因子参与了RA的发病机制相关的免疫应答中，促进自身免疫反应、慢性炎症的形成过程及组织的破坏。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-1β（IL-1β）的抑制剂已在临床中广泛应用于RA的治疗，并取得了良好的效果。这一点同时也支持细胞因子在RA中发挥重要作用的观点，基因治疗的靶基因，特别是细胞因子相关的靶基因是重要的研究方向。

TNF-α在RA的发病机制中有重要作用，在RA滑膜组织中调节其他促炎性细胞因子的产生。TNF-α主要由巨噬细胞产生，同样也可以由单核细胞、成纤维细胞、肥大细胞及自然杀伤细胞等产生。目前的研究发现，TNF-α有2个受体，即TNF-RⅠ受体及TNF-RⅡ受体。TNF-RⅡ受体有更多的限制，主要在调节性T细胞中高度表达[4]。TNF-α的免疫功能主要是通过诱导促炎性细胞因子，以及刺激免疫细胞的免疫效应来发挥作用的，而刺激免疫细胞往往是通过TNF受体来介导的[5]。Rossol等[6]通过实验发现，TNF-α和TNF-RⅠ之间的相互关系在滑膜内T细胞的转移中有重要作用。收集RA的滑膜组织切片在体外环境下培养，在荧光显微镜下可以观察到转移的CD4+T细胞，结果表明，来自RA患者的CD4+T细胞转移到滑膜组织中，而健康对照组的CD4+T细胞并没有转移到滑膜组织中。在对比实验中发现，TNF-RⅠ和ICAM-1是CD4+T细胞转移至滑膜液中必不可少的条件[6]。

IL-1家族主要包括11种细胞因子，即7种促炎性细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ）和4种抗炎性细胞因子（IL-1Ra、IL-36Ra、IL-37、IL-38），在介导免疫应答中有重要的作用[7]。内源性抑制剂IL-1Ra具有阻断IL-1α及IL-1β的作用，IL-1的受体包括IL-1RⅠ及IL-1RⅡ。编码IL-1α、IL-1β及IL-Ra的基因存在多态性，该位点的基因多态性提高了RA的易感性以及改变了IL-1的生成。IL-1β基因rs 169 44位点的多态性同样影响IL-1的表达，这也与RA患者的关节损害密切相关[8]。IL-Ra主要是通过刺激单核细胞的抗炎细胞因子产生的。Hu等[9]将IL-Ra基因转染至间充质干细胞，量化重组骨髓间充质干细胞产生的IL-Ra相关蛋白，然后观察APA微囊剂的渗透性，并通过对CIA小鼠模型的治疗来评估临床效果，结果表明，带有IL-Ra基因转染的间充质干细胞对RA有潜在治疗效果[9]。

一些生长因子已经被证实在骨科疾病模型中有一定的治疗效果。骨形成蛋白（BMPs）在软骨及骨的形成中有重要的作用[10]，特别是BMP-2及BMP-7有最大的成骨效能，并且已经被批准用于临床的重组蛋白。但是由于其半衰期短以及能够明显降低细菌表达蛋白的活性，故这种蛋白疗法是有限的[11]。基因治疗可以通过高水平的局部转基因表达来克服这些缺点。某些生长因子已被用于RA治疗的研究，例如转化生长因子-β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等。最近有研究表明，IGF-1的基因治疗获得了有限的成功。腺病毒载体介导的IGF-1在体外转染骨髓间充质干细胞中不能促进软骨的分化，但是在软骨的形成中表达TGF-β1有协同作用[12]。腺病毒作为载体能够成功在体外环境下将马的IGF-1转导入马的软骨细胞。将这种经过修饰的细胞再导入有15 mm软骨破损的股膝关节中，能够观察到基质的合成及软骨的修复[13]。RA相关的促炎性细胞因子，例如TNF-α及IL-1β能够产生IGF-1的抵抗，这些研究表明IGF-1在RA的基因治疗中有较好的研究前景。

2.2 细胞凋亡基因的治疗 许多研究表明，在人类自身免疫性疾病中，外周血存在单核细胞过度的细胞凋亡，而不一定是有缺陷的免疫细胞的凋亡，通过诱导细胞凋亡以及抑制细胞周期的延长改善RA关节破坏是一种新的治疗方向。目前发现在Fas基因的启动子区域，2个单核苷酸多态性是已经被证实了，主要包括-1377G-A和-670A-G。这些单核苷酸多态性的生物学功能还不确定，而Fas-1377位点的多态性可能与转录因子SP-1序列有关。Fas/FasL启动子区的基因变化可能在影响RA细胞凋亡中有重要意义[14]。

FasL是Fas在体内的天然配体，属于TNF/LT家族。细胞凋亡机制的受损以及Fas基因的过度表达可能导致多种遗传性疾病。当Fas与FasL结合后，可以导致携带有Fas的细胞发生凋亡，而细胞膜上的Fas与Fas交联成Fas三聚体，继而诱导Fas分子胞质区死亡结构域（DD）与一种含有死亡结构域的Fas相关蛋白（FADD）结合，最终导致细胞凋亡的发生。CTLA4-FasL是CTLA4和FasL的胞外结构域的融合产物，是将T细胞的两种抑制分子整合到同一个分子中。重组腺相关病毒（AAV）编码鼠CTLA4-FasL融合基因（rAAV.CTLA4-FasL）注射到小鼠踝关节内后，观察到rAAV.CTLA4-FasL抑制了AIA模型中小鼠关节炎的进展，这表明关节腔内局部注射CTLA4-FasL可能对RA疾病的进展有潜在的治疗效果[15]。

2.3 核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂 RA的滑膜成纤维细胞中信号转导通路的中断是转基因治疗的新方向，可以通过抑制或者激活转录因子的信号转导机制，减少细胞因子介导的慢性炎症。NF-κB在分化、代谢以及CNS的某些特定功能中有重要作用[16]。NF-κB是由5种DNA相关蛋白组成，主要包括relA（p65）、relB、c-rel、p50以及p52等。这些二聚体被细胞抑制剂抑制其功能，当信号介导导致细胞抑制剂降解后能够释放其功能，能够在滑膜成纤维样细胞的培养中以及RA患者的滑膜组织中检测到NF-κB的活化，在关节炎动物模型中同样能够检测到NF-κB在RA的疾病发展中有重要的作用[17]。

最近的研究表明，与NF-κB信号遗传相关的基因包括CD40、TRAF1、TNFAIP3以及c-REL，同样也强调了NF-κB的活化在RA发病机制中的重要作用[18]。目前研究表明，NF-κB的活化主要有2条路径[19]。在经典的路径中，细胞质中的IκBα抑制p50/rel A二聚体的功能。激活经典路径的信号主要包括抗原受体以及细胞因子受体，细胞因子受体主要为TNFR1、IL-1R以及Toll样受体（TLR）。另外一条非经典路径是NF-κB的活化，包括p100和p105等4种NF-κB亚基。p100和p105分别是p52和p50的前体[20]。齐晅等[21]分别取RA和健康人群的成纤维样滑膜细胞（FLS）进行培养，然后分别用相同剂量的NF-κB抑制剂，结果表明，与对照组相比，NF-κB能够诱导FLS的凋亡，并抑制促炎性细胞因子TNF-α以及IL-1β的释放。基因的相关性分析能够帮我们预测疾病的风险以及潜在的治疗方案，通过全基因组相关分析（GWAS）发现，NF-κB路径可能是RA发病的潜在危险因素[20]。

3 基因治疗在动物模型中的进展

目前建立动物RA模型的方法较多，主要有小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）、大鼠链球菌细胞壁诱导关节炎（SCW）、小鼠酵母聚糖诱导关节炎（ZIA）、兔抗原诱导关节炎（AIA）。国内许多实验室利用CIA模型进行筛选药物、转基因、免疫治疗及发病机制方面的研究。

CIA模型被用来研究已经超过30年，即使现在仍能从小鼠CIA模型中学到很多，然而CIA模型只模拟了人类RA的一小部分模型片段。RA患者与小鼠CIA模型的不同主要体现在缺乏性别差异，以及RA患者会产生类似于类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽抗体（抗CCP抗体）之类的抗体。

4 RA基因治疗的临床试验

美国的匹兹堡大学在1996年完成实施了第1例

应用基因转移技术治疗RA的临床试验，主要实验方法是将治疗基因转移至RA患者关节中，用以确定对RA患者治疗的可行性及安全性。主要研究对象是需要关节置换术的严重RA终末期患者，将携带有IL-1Ra基因输入到RA的第2～5掌指关节中，在RA患者的其他炎性关节置换术中获得了自体滑膜细胞的培养。将这些培养的自体滑膜细胞扩增，其中一半被逆转录病毒转染，另一半未修饰的滑膜细胞保持自体遗传的同源性作为对照组。培养这些滑膜细胞，并将其重新注入掌指关节中。其中有

2个关节获得IL-1Ra表达的细胞，另外2个关节获得未修饰的滑膜细胞。通过ELISA和PCR分析，结果表明，带有IL-1Ra基因的确转入关节中，并得到有效表达[22]。

尽管逆转录病毒在临床试验中得到有效应用，逆转录病毒本身存在安全问题及费用问题，因此在RA这类非致死性疾病中，研究者们开始采用相对更安全、更便宜的腺病毒载体。腺病毒载体已经成功运用于超过47项人类临床试验中，总共有600多例患者[23]。Targeted Genetics公司进行了一项针对RA基因治疗的临床试验研究，主要是测试能够完全编码TNFR：Fc的单链rAAV2病毒的临床有效性，这种目的基因产物主要是结合了胞外的人类TNF-RⅡ及IgG1的Fc结构区。在临床试验进程一半的时候，发现单个和重复的关节腔内注射AVV2-TNFR：Fc（tgAAC94）是安全的，并且具有良好的耐受性[24]。然而在2007年6月24日

1例36岁的RA患者于第2次关节腔内注射22 d后死亡[25]，FDA立即叫停了这项临床试验，并对患者死亡原因进行调查。调查结果显示，患者死亡原因与本次试验的tgAAC94无明显相关性，故于同年9月允许此临床试验继续进行[31]。试验结果表明，rAAV载体是安全的，而且通过关节外的检测证实目前并没有证据表明关节外TNFR：Fc的过度表达。临床结果证实，实验组相比对照组，靶关节的临床症状得到较好的改善[32]。基因治疗临床试验的成功证实了将基因转导入靶关节中，并得到有效、稳定、持续的表达是可能的，这为RA治疗方法的探索提供了新的研究方向。

5 问题及展望

近来RA的基因治疗发展较快，通过试验研究获得了较大的突破及发展；但是目前基因治疗RA存在一些问题。主要包括：①基因治疗RA的实验研究缺乏理想的RA动物模型，目前的动物模型只有关节炎症的单次发作或者一个阶段的发展。②带有目的基因的载体可能播散到靶器官外，目的基因难以稳定表达，并且目的基因的调控也存在问题。③最大的限制性问题是缺乏理想的载体，目前使用最多的是逆转录病毒、腺病毒及非病毒载体。逆转录病毒能稳定表达，体内转染率低，并且是随机整合到体细胞染色体上的，已经证明野生的逆转录病毒可引起细胞恶变。腺病毒载体转染率高，但是不能稳定表达，并且腺病毒存在免疫原性。非病毒载体的主要优点是安全、稳定，主要缺点是转基因的表达时间短，在活体细胞中的转染率较低。目前没有一个载体能够安全、稳定、有效地表达。有理由相信，随着载体、基因调控和转染效率的不断完善，基因治疗将成为治疗RA的有效手段。

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收稿日期：2016-06-29；修回日期：2016-07-25