大豆异黄酮影响类风湿性关节炎模型大鼠FLS凋亡

缪成贵 秦梅颂 陈建中 李成凤 张 兵 李小枫 李 俊

(安徽科技学院食品药品学院1，凤阳 233100)(安徽医科大学第一附属医院2，合肥 230032)(安徽医科大学药学院3，合肥 230032)(安徽科技学院家禽疫病监测安徽省重点实验室4, 凤阳 233100)

大豆异黄酮影响类风湿性关节炎模型大鼠FLS凋亡

缪成贵1，3，4秦梅颂1陈建中1李成凤1张 兵2李小枫3李 俊3

(安徽科技学院食品药品学院1，凤阳 233100)(安徽医科大学第一附属医院2，合肥 230032)(安徽医科大学药学院3，合肥 230032)(安徽科技学院家禽疫病监测安徽省重点实验室4, 凤阳 233100)

采用完全弗氏佐剂制备类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)模型对照大鼠，模型对照大鼠采用大豆异黄酮(Soybean isoflavone, SBI)灌胃治疗后，分离大鼠滑膜组织，原代培养大鼠(Fibroblast like synoviocytes, FLS)，real time qPCR分别检测SBI各剂量灌胃治疗对模型对照组大鼠FLS细胞凋亡相关基因和RA相关基因表达的影响。结果发现，经SBI 50 mg/kg体重、100 mg/kg体重和150 mg/kg体重3个剂量灌胃治疗后，细胞凋亡因子caspase 3、促凋亡基因Bax表达显著升高，抗凋亡基因Bcl-2表达显著降低，MMP3和fibronectin表达同样显著降低。SBI可能通过促进FLS凋亡影响模型对照组大鼠滑膜增值和关节炎症。

大豆异黄酮 类风湿性关节炎 caspase 3 Bax Bcl-2

大豆异黄酮(Soybean isoflavone, SBI)是大豆黄酮类成分的一种，是大豆生长过程中形成的次级代谢产物。SBI具有雌激素类似的结构特征，进入人体内能发挥雌激素样作用，影响多种生理病理过程[1-2]。类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、系统性的自身免疫性疾病，全世界发病率0.5%～1.0%，我国发病率约为0.5%[3-4]。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast like synoviocytes, FLS)的激活增殖是RA发病的关键因素[5]，细胞凋亡因子caspase 3、细胞凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2和RA相关基因fibronectin、MMP3的异常表达能通过影响FLS的增殖凋亡影响RA的病理变化[6]。佐剂性关节炎与RA具有相似的病理特点，是常用的研究RA发病和治疗的动物模型[7]。本试验以caspase 3、Bax、Bcl-2，以及RA基因MMP3、fibronectin为研究靶点，研究SBI对FLS凋亡的影响，对RA相关基因MMP3、fibronectin表达的影响，为RA的防治提供新思路新方法，为SBI功效研究提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

细胞培养箱：美国热电Forma 3111；超纯水系统：美国密理博Milli-Q Reference；倒置荧光显微镜：奥林巴斯IX73+DP80；实时定量PCR仪：美国ABI公司；超净工作台：上海智城ZHJH-C1214C。

1.1.2 试剂

SBI：黑龙江永贞堂保健品有限公司，SBI 89.52%；布洛芬，中美天津史克制药有限公司；QuantiFast© SYBR© Green PCR试剂盒：Qiagen公司产品；逆转录试剂盒，Fermentas；caspase 3、Bax、Bcl-2、MMP3、fibronectin定量PCR引物：上海生工。

1.2 试验方法

1.2.1 模型对照组大鼠制备

SD雄性大鼠购自安徽医科大学实验动物中心，体重180～200 g，透气笼常规饲养，合格证号：皖医实动准字第01号。实验大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、SBI 50 mg/kg试验组、SBI 100 mg/kg试验组、SBI 150 mg/kg试验组，布洛芬8 mg/kg阳性对照组，实验动物采用完全随机设计分组，每组10只。适应性饲养7 d后制备模型对照大鼠，正常对照组大鼠右后足趾注射0.1 mL PBS作为对照，其他5组大鼠采用完全弗氏佐剂于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL致炎方法制备模型对照组大鼠。试验组和阳性对照组大鼠采用常规灌胃方法灌胃药物，每日灌胃时间为上午10点至11点，分组方案及灌胃量见表1。

表1 实验大鼠分组方案

1.2.2 大鼠滑膜FLS原代培养

模型对照组大鼠制备后第4天，各治疗组大鼠灌胃给药治疗，第28天股动脉处死各组大鼠，超净台内无菌分离各组大鼠膝关节滑膜组织，D-Hanks液漂洗3次后，小剪刀剪碎滑膜组织。采用玻璃吸管将滑膜碎块转移至一次性细胞培养瓶底部，均匀排列后每瓶细胞加含有胎牛血清的DMEM培养基2 mL，盖好盖子后倒置细胞培养箱内培养7 h，然后翻正继续培养至细胞长出组织块。待FLS长出组织块后去除组织块，更换培养基3 mL继续培养3 d至细胞覆盖瓶底90%，弃净培养基，加胰蛋白酶1 mL 1 min，玻璃吸管吹打消化后传代培养，试验采用3～5代细胞。

1.2.3 模型对照组大鼠关节炎评分

采用大鼠关节炎评分法研究SBI对模型对照组大鼠关节炎的治疗作用，给药剂量为8 mg/kg布洛芬作为阳性药物，用于对比分析SBI的治疗作用。大鼠关节炎评分标准如下：1只模型对照组大鼠耳朵出现红肿和结节记1分，1只模型对照组大鼠鼻子出现红肿和结节记1分，1只模型对照组大鼠尾巴出现红肿和结节记1分，1只模型对照组大鼠足爪出现红肿和结节记1分，每只模型对照组大鼠最高评分为8分。

1.2.4 Real time qPCR检测大豆异黄酮对caspase 3、Bax、Bcl-2基因表达的影响

Caspase 3、Bax、Bcl-2定量PCR引物由上海生工合成。采用Trizol试剂常规方法提取各组FLS总RNA，参照Fermentas试剂盒提供的方法逆转录得到各组大鼠FLS总RNA对应的cDNA。参照Qiagen公司试剂盒提供的方法，采用real time qPCR检测Bax、caspase 3、Bcl-2基因在空白对照组大鼠、模型对照组大鼠、各治疗组大鼠FLS中表达。Real time qPCR扩增反应条件为：94 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。扩展反应40个循环。定量PCR引物序列见表2。

1.2.5 Real time qPCR检测大豆异黄酮对MMP3、fibronectin基因表达的影响

MMP3、fibronectin定量PCR引物由上海生工合成。采用Trizol试剂、常规方法提取各组大鼠FLS总RNA，参照Fermentas试剂盒提供的方法，逆转录得到各组大鼠对应的cDNA。采用real time qPCR检测RA相关基因MMP3、fibronectin在空白对照组大鼠、模型对照组大鼠、各试验组大鼠FLS中表达。Real time qPCR扩增反应条件为94 ℃，15 s；60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共40个循环。定量PCR引物序列见表2。

表2 real time qPCR引物序列

1.2.6 统计学分析

2 结果与分析

2.1 SBI对模型对照组大鼠治疗作用

采用大鼠关节炎评分法研究SBI对模型对照组大鼠的治疗作用，采用布洛芬作为阳性药物。结果如图1所示，模型对照组大鼠制备成功后第4天给药，分别在第12天、第16天、第20天、第24天、第28天和第32天进行大鼠关节炎评分。第16天开始，剂量为50、100、150 mg/kg的SBI均能显著降低大鼠关节炎评分分值，即SBI具有显著的治疗模型对照组大鼠的作用。与阳性药物布洛芬相比，SBI各组大鼠关节炎评分分值没有差别，即SBI具有与常规抗炎药布洛芬相似的抗炎作用。

注：与空白对照组相比﹡P<0.05，与模型对照组相比#P<0.05，n=10。

图1 SBI对模型对照组大鼠关节炎评分分值的影响

2.2 Real time qPCR检测SBI对caspase 3、Bax、Bcl-2基因表达的影响

采用real time qPCR检测caspase 3、Bax、Bcl-2在空白对照组、模型对照组、各试验组大鼠FLS中表达，图3结果显示，与空白对照组相比，caspase 3、Bax在模型对照组大鼠FLS中表达显著降低，Bcl-2表达显著升高；与模型对照组大鼠相比，caspase 3、Bax在各试验组FLS中表达显著升高，Bcl-2表达显著降低；同时SBI试验组与阳性药物组相比没有显著性差异，提示SBI具有较好的促进模型对照大鼠FLS凋亡的作用。

注：a：Real time qPCR检测空白对照组、模型对照组、各试验组、阳性药物组大鼠FLS中caspase 3基因表达；b：Real time qPCR检测空白对照组、模型对照组、各试验组、阳性药物组大鼠FLS中Bax基因表达；c：Real time qPCR检测空白对照组、模型对照组、各试验组、阳性药物组大鼠FLS中Bcl-2基因表达。与空白对照组相比﹡P<0.05，与模型对照组相比﹟P< 0.05，n=3 (图3同)。

图2 Real time qPCR检测SBI对caspase 3、Bax、Bcl-2基因表达的影响

2.3 Real time qPCR检测SBI对MMP3、fibronectin基因表达的影响

采用real time qPCR检测MMP3、fibronectin在空白对照组、模型对照组、各试验组、阳性药物组大鼠FLS中表达，图3结果显示，与空白对照组相比，MMP3、fibronectin在模型对照组大鼠FLS中表达显著升高；与模型对照组大鼠相比，各SBI试验组大鼠FLS中MMP3、fibronectin表达显著降低；与阳性药物组相比，SBI各试验组大鼠FLS中MMP3、fibronectin表达没有明显差异。结果表明大豆异黄酮具有抑制模型对照组大鼠FLS中MMP3、fibronectin表达的作用。

注：a: Real time qPCR检测空白对照组、模型对照组、SBI各试验组、阳性药物组大鼠FLS中MMP3表达；b: Real time qPCR检测空白对照组、模型对照组、SBI各试验组、阳性药物组大鼠FLS中fibronectin表达。

图3 Real time qPCR检测SBI对MMP3、fibronectin基因表达的影响

3 结论

与空白对照相比，模型对照组大鼠FLS中caspase 3、Bax表达显著降低，抗凋亡基因Bcl-2显著升高。与模型对照组大鼠相比，SBI治疗后，caspase 3、Bax表达显著升高，抗凋亡基因Bcl-2显著降低。与阳性药物组大鼠相比，SBI治疗组大鼠FLS中caspase 3、Bax和Bcl-2表达没有显著差异，提示SBI对模型对照组大鼠FLS凋亡是有影响的，并且与常规抗炎药物布洛芬有类似的作用。

与模型对照组大鼠相比，SBI治疗后MMP3、fibronectin表达显著降低，与阳性药物组相比，SBI的作用与布洛芬没有明显差别，提示SBI具有较好的抑制MMP3、fibronectin表达的作用，并且这种作用与常规抗炎药布洛芬相似。此类研究为RA的防治提供新的思路，也为大豆功效研究提供新的试验参考。

[1]Mahmoud A M, Yang W, Bosland M C. Soy isoflavones and prostate cancer: a review of molecular mechanisms [J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 140(3):116-32

[2]王燕,王艳春,范红艳,等.大豆异黄酮药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报, 2013, 34(3): 225-228

[3]Krause M L, Matteson E L. Perioperative management of the patient with rheumatoid arthritis [J]. World Journal of Orthopedics, 2014, 5(3):283-91

[4]Yoshida K, Hashimoto T, Sakai Y, et al. Involvement of the circadian rhythm and inflammatory cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis [J]. Journal of Immunology Research, 2014, 2014: 282495

[5]El-Jawhari J J, El-Sherbiny Y M, Jones E A, et al. Mesenchymal stem cells, autoimmunity and rheumatoid arthritis [J]. Quarterly Journal of Medicine, 2014，107(7):505-514

[6]McMahon S B. MYC and the Control of Apoptosis [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2014;4(7):a014407

[7]陈晓宇,李俊,解雪峰, 等. 野菊花总黄酮诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡[J]. 解剖学报,2007,38(5):569-571.

Effects of Soybean Isoflavone on the Fibroblast Like Synoviocytes Apoptosis in Rheumatoid Arthritis Model Rats

Miao Chenggui1,3,4Qin Meisong1Chen Jianzhong1Li Chengfeng1Zhang Bing2Li Xiaofeng3Li Jun3

(Food and Drug College, Anhui Science and Technology University1, Fengyang 233100)(The First Affiliated Hospital, Anhui Medical University2, Hefei 230032)(College of Pharmacy, Anhui Medical University3, Hefei 230032)(Poultry Disease Monitoring Anhui Key Laboratory, Anhui Science and Technology University4, Fengyang 233100)

Rheumatoid arthritis (RA) model rats were prepared with complete Freund's adjuvant, and were treated with soybean isoflavone (SBI) via intragastric administration, then the synovial tissue of RA model rats was separated and cultured for fibroblast like synoviocytes (FLS). The effect of varied-dose SBI on the expression of apoptosis related gene and RA related gene were detected by real time qPCR. The results showed that three dose treatment (50 mg/kg weight, 100 mg/kg weight and 150 mg/kg weight) significantly increased the expression of cell apoptosis factor caspase 3, pro-apoptotic gene Bax, decreased the anti-apoptosis gene Bcl-2 expression and the expression of MMP3 and fibronectin was decreased at the same time. SBI may affect the synovium proliferation and joint inflammation of control rats by promoting the FLS apoptosis.

soybean isoflavone, rheumatoid arthritis, caspase 3, Bax, Bcl-2

S565

A

1003-0174(2016)02-0001-04

国家自然科学基金(81302783)，安徽省高校振兴计划人才项目(098)，安徽省教育厅科研项目(KJ2013 B082)，安徽科技学院科研项目(ZRC2013378)，滁州市科技局科研项目(201306)，安徽省教育厅科研项目(KJ2012Z069).

缪成贵，男，1981年出生，博士，副教授，抗炎免疫药理学