转录因子twist在食管癌中表达的意义

贺 波，郑琇山，姜建青，俞永康，郑轶峰，李 卫，杨 列，梁 瑜

转录因子twist在食管癌中表达的意义

贺 波，郑琇山，姜建青，俞永康，郑轶峰，李 卫，杨 列，梁 瑜

目的研究转录因子twist在食管鳞状细胞癌（简称食管癌）中细胞亚定位及临床意义。方法采用免疫组化染色方法检测twist在58例食管癌及对应癌旁组织表达情况，并分析其细胞亚定位与患者性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期、淋巴结转移等临床资料的关系。结果twist在食管癌细胞浆及细胞核中表达水平均显著高于癌旁组织（P＜0.01）；twist在细胞浆的表达水平与患者性别、年龄、位置、TNM分期及淋巴结转移均无显著相关性（P＞0.05）；twist在食管癌细胞核中的高表达与患者TNM分期及淋巴结转移密切相关(P＜0.01)，而与患者性别、年龄及食管癌位置无显著相关性（P＞0.05）。结论twist在食管癌细胞核中高表达，与肿瘤恶性进展密切相关，可能是食管癌恶性进展的重要标记物。

食管；鳞状细胞癌；转录因子；twist；TNM分期；临床意义

食管癌在全球肿瘤发病率占第8位，死亡率居第6位，尽管近年来在手术及放化疗方面取得一定进展，但食管癌易发生转移是导致患者死亡的重要原因[1]。由于缺乏有效的生物标记物及治疗靶点，食管癌早期诊断主要依靠内镜检查。但大多数患者具有临床症状后才能发现，一般已处于中晚期，其预后生存仍然较差。因此研究与寻找食管癌发生及转移的生物标记物，对提高食管癌临床诊治水平至关重要。twist为一种调节表皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要转录因子[2]，在肿瘤恶性进展中发挥重要作用，是目前的明星分子，但其在食管癌中的生物学作用研究较少，本研究应用免疫组化染色方法研究其在食管癌中表达的临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2012年6月～2014年5月在本科行食管癌切除患者58例，其中男性37例，女性21例，年龄38～72（52.3±10.6）岁。均因进食梗阻、胸骨后不适、烧心、黑便等原因行电子胃镜检查发现食管占位性病变，并经组织活检确定为食管鳞状细胞癌；术前均未接受针对肿瘤的任何治疗。手术切除标本经福尔马林固定、石蜡包埋后存放于我院病理科。

1.2 免疫组化染色 将上述患者的食管癌及癌旁组织蜡块切片烘干后，将切片浸泡于100%二甲苯中30 min，后更换另一组100%二甲苯中浸泡30 min；然后将切片依次置于100%、90%、80%及70%乙醇中分别浸泡8 min，PBS冲洗3次，每次5 min；切片置于煮沸的pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中3 min进行抗原修复后，滴加正常山羊血清进行抗原封闭30 min，3%H2O2中放置20 min去除过氧化酶活性，再次PBS清洗3次。滴加PBS配制的小鼠抗twist单克隆抗体 (1∶500,Abcam)，于4℃冰箱过夜。用PBS充分清洗切片3次，每次5 min，滴加兔抗鼠二抗（1∶2000，北京中杉公司），室温下静置40 min后，再次PBS充分清洗，DAB显色液显色，大约30 s后显色清楚后清水清洗。苏木精复染3 min后，清水冲洗3 min,蒸馏水漂洗2 min后，再将切片滴加树脂并用盖玻片封片。

1.3 免疫组化结果判定 免疫组化结果由我院资深病理师在Olympus显微镜下进行，以细胞浆或细胞核呈黄色或棕黄色为阳性信号，先在低倍镜(50×)下大体观察表达情况，然后取100倍视野下进行计数与拍照。按细胞着色程度评分：0分（无着色）；1分（浅黄色）；2分（棕黄色）；3分（棕褐色）；按色细胞比例评分：0分（无阳性细胞）；1分（阳性细胞比例1%～25%）；2分（26%～50%）；3分（51%～75%）及4分（76%～100%）。两项的积分之和＜3分记为阴性（-），3～7分为阳性（+）。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间阳性表达率比较采用χ2检验，twist表达水平与患者临床参数关系采用Kruskal-Wallis U检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 twist在食管癌及癌旁组织细胞亚定位情况免疫组化染色结果显示，twist可在细胞核及细胞浆呈阳性表达，其在食管癌组织细胞浆阳性及阴性表达率分别为34.5%（20/58）、65.5%（38/58）；在食管癌细胞核阳性与阴性表达率分别为 72.4%（42/58）、27.6%（16/58）。twist在癌旁组织中细胞浆阳性及阴性表达率分别为17.2%（10/58）、82.8%（48/58）；在癌旁组织细胞核阳性与阴性表达率分别为13.8%（8/58）、86.2%（50/58）。统计学分析提示，twist在食管癌细胞浆与细胞核中阳性表达率均显著高于癌旁组织(P＜0.05，图1）。

图1 免疫组化染色tw ist在食管癌及癌旁组织中表达

2.2 twist在食管癌细胞亚定位与临床资料的相关性 入选患者食管癌位于食管上、中、下分别为6、 32、20例；TNM分期中Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ+Ⅳ期分别为27、31例；淋巴结转移N0+N138例，N2及以上患者20例。进一步分析twist在食管癌细胞亚定位与患者临床参数的相关性发现，twist在细胞浆中表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期及淋巴结转移均无显著相关性（P＞0.05），提示其在食管癌细胞浆中的表达与肿瘤恶性进展程度无相关性；twist在食管癌细胞核中的表达水平与患者性别、年龄及食管位置无显著相关性（P＞0.05），但其高表达与更晚的患者TNM分期及淋巴结转移显著相关 （P＜0.05，表1），提示twist在细胞核中的高表达与食管癌恶性进展密切相关。

3 讨论

食管癌是世界高发的恶性肿瘤，尤其是四川地区近年来发病率逐年上升，已被国家列为十大特色肿瘤之一[3]。据报道，中晚期食管癌5年的生存率非常低，大多数研究报道均不超过10%，而早期食管癌可以通过内镜下、胸腔镜或开胸手术切除，患者可获得很好的预后、甚至治愈。但是由于我国人口众多，加上胃镜检查对患者带来痛苦，因此，无法将电子胃镜检查作为常规体检项目，而大多数早期食管癌患者无任何症状，当出现进食梗阻、胸骨后不适时，大多数处于中晚期，使食管癌早期诊断患者较少，在本研究患者中TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期患者只有46.5%（27/58），而Ⅲ+Ⅳ期患者达53.4%（31/58）；手术切除样本中，只有15例未发现淋巴结转移，其余43例均发现淋巴结转移，提示早期诊断患者比例较小，是造成预后差的重要原因。另外，目前针对食管癌早期诊断、生物靶向治疗的标记物报道较少，且由于肿瘤的异质性使单一分子标记物无法满足临床诊断与治疗需要，因此，寻求高效的食管癌标记物意义重大。

表1 twist在食菅鳞状细胞癌中亚定位与临床参数的相关性（例）

本研究结果显示，twist在食管癌细胞浆及核中阳性表达率均显著高于对应的癌旁组织，进一步分析发现，twist在细胞浆中表达水平与患者性别、年龄、TNM分期及淋巴结转移等临床参数均无相关性，提示twist在细胞浆中的表达水平与食管癌恶性进展无相关，其具体的的生物学功能尚需进一步深入研究。但分析twist在食管癌细胞核中表达的意义发现，其表达水平与患者性别、年龄、食管位置无显著相关性，而其高表达与患者较晚的TNM分期及淋巴结转移密切相关，提示twist的表达水平与食管癌发生、发展、侵袭及转移等恶性生物学行为相关，可能在食管癌恶性进展中发挥重要作用，也可能是一种重要的分子标记物。也进一步说明twist作为一种重要的转录因子，其在肿瘤恶性进展中发挥生物学功能的地点位于细胞核。

在胃癌中，twist可通过调控Siah2来促进HP感染相关胃癌细胞的恶性增殖[4]；另一项研究表达，在胃癌中PAQR3可促进twist的降解来抑制EMT发生，从而抑制胃癌细胞侵袭、迁移及转移能力[5]。对其上游调控分子研究发现，在结肠癌细胞中，非编码小RNA miR-381可通过抑制twist的转录水平发挥抑制肿瘤细胞恶性生长的作用[6]。在非小细胞肺癌的研究中发现，miR-32可通过靶向抑制twist来抑制肿瘤细胞增殖、EMT及转移[7]。在肝癌研究中发现，miR-26b-5p是其上游调控的又一重要分子[8]。本研究结果提示twist在食管癌发生、发展中可能起重要作用，但是否通过调节食管鳞状细胞癌EMT来发挥作用？其上游调控分子机理又是什么？有待于将来的研究中深入探讨。

总之，本研究通过免疫组化方法研究发现，twist的核定位在食管癌发生、发展及转移等恶性生物学行为中起重要作用，可能是食管癌重要的生物标记物，为进一步研究食管癌发生及转移机制提供了线索。

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[3] 赫捷,邵康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策[J].中国癌症杂志,2011,21(7):501-504．

[4] Das L,Kokate SB,Rath S,et al.ETS2 and Twist1 promote invasiveness of helicobacter pylori-infected gastric cancer cells by inducing Siah2[J].Biochem J,2016,473(11):1629-1640.

[5] Guo W,You X,Xu D,et al.PAQR3 enhances twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J].Carcinogenesis,2016,37(4):397-407.

[6] He X,Wei Y,Wang Y,et al.MiR-381 functions as a tumor suppressor in colorectal cancer by targeting twist1 [J].Onco Targets Ther,2016,7(9):1231-1239.

[7] Li L, Wu D. miR-32 inhibits proliferation, epithelialmesenchymal transition,and metastasis by targeting twist1 in non-small-cell lung cancer cells[J].Onco Targets Ther,2016,14 (9):1489-1498.

[8] Wang Y,Sun B,Zhao X,et al.Twist1-related miR-26b-5p suppresses epithelial-mesenchymal transition,migration and invasion by targeting SMAD1 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget,2016,doi:10.18632/oncotarget.8328.

Significance of expression of transcription factor twist in esophageal squamous cell carcinoma

He Bo,Zheng Xiushan,Jiang Jianqing,Yu Yongkang,Zheng Yifeng,Li Wei,Yang Lie,Liang Yu Department of Thoracic Surgery，General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan，610083,China

Objective To study the clinical significance of the expression of transcription factor twist in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).MethodsThe immunohistochemical staining was used to detect the expression of twist in 58 pairs of ESCC and matched non-cancerous tissues,and the relationship between twist expression in ESCC cytoplasm and nuclear with patient age, gender,tumor location,TNM stage and lymph node metastasis was analysized.ResultsBoth the expression of twist in ESCC cytoplasm and nuclear were significantly higher than that in matched non-cancerous tissues(P＜0.01).The expression of twist in ESCC cytoplasm was not statistically correlated with patients'clinical parameters(P＞0.05);the expression of twist in ESCC nuclear was significantly correlated with advantaged TNM stage and lymph node metastasis,but not with age,gender or tumor location(P＞0.05).ConclusionThe highly expression of twist in ESCC nuclear is correlated with the malignant progression of tumor,indicating that twist expression in nuclear is a critical markers of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma;twist；expression;cell nuclear

R 735.1

A

1004-0188（2016）12-1419-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.019

2016-06-16）

成都军区总医院研究型人才资助项目（2013YG_B027）

610083，成都，成都军区总医院胸外科

郑琇山，Email:xiushanzheng@126.com