抗生素对鸡粪厌氧发酵过程影响的实验研究

范 超，王 欣，刘 伟，高德玉，苏小红，秦国辉，刘旭丹，王玉鹏

(黑龙江省科学院科技孵化中心，哈尔滨 150090；黑龙江省能源环境研究院，哈尔滨 150090)

抗生素对鸡粪厌氧发酵过程影响的实验研究

范 超，王 欣，刘 伟，高德玉，苏小红，秦国辉，刘旭丹，王玉鹏

(黑龙江省科学院科技孵化中心，哈尔滨 150090；黑龙江省能源环境研究院，哈尔滨 150090)

采用实验室批式厌氧发酵装置，在新鲜鸡粪中添加不同含量的抗生素后进行高温厌氧发酵实验，研究抗生素对鸡粪厌氧发酵过程的影响。结果表明:进行单因素实验时，低浓度抗生素的添加对发酵无明显抑制，总产气率变化不大；当土霉素和金霉素含量大于5mg·kg-1、阿莫西林大于10mg·kg-1，总产气率下降。进行正交实验研究抗生素的联合抑制时，土霉素与金霉素对厌氧发酵的影响更为显著，最佳的因素水平组合为土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1，此时抗生素对发酵影响最低。

厌氧发酵；抗生素；显著性

随着规模化畜禽养殖业的发展，畜禽粪便带来的有机固体废弃物和高浓度有机废水造成了严重的环境污染，成为制约我国畜禽生产的重要因素之一[1-2]。畜禽粪便是一种环境污染物，同时也是一种可利用的资源，因其含有大量有机物质及N、P、K等多种营养成分，经过适当处理后不仅能减少其对环境的污染，得到的副产物还增加了其经济价值[3]。畜禽粪便无害化处理和资源化利用的主要途径有发酵生产有机肥及厌氧发酵制取沼气[4]。厌氧发酵不受含水率影响，还能产生清洁能源，是一种畜禽粪便处理和利用的有效途径。

近年来，在现代畜禽养殖场中，抗生素被广泛用来抑制有害细菌的生长、预防和治疗畜禽疾病、促进生长等[5]。但由于消化系统的问题，大部分不能被畜禽完全吸收利用，高达60%～90%的抗生素以原样排泄或排泄之后转化为母体，在环境中残留[6]。抗生素不仅是一种难降解的有机物，它的存在还在一定程度上抑制了禽畜粪便的生物处理过程[7]。在畜禽养殖使用的抗生素中，四环素类占的比重较大，可达40%左右，在常见的抗生素药物中毒性最强，并具有生物累积性。常用的四环素类抗生素有四环素、金霉素、土霉素等[8]。阿莫西林属于β-内酰胺药物抗生素，其杀菌机制是抑制细菌细胞壁合成[9]。这些抗生素经畜禽消化后以粪便排出，而采用含有抗生素的畜禽粪便为原料进行厌氧发酵，将关系到厌氧发酵的效率。

本实验采用养鸡场常用的土霉素、金霉素和阿莫西林，研究了这3种抗生素的不同含量对鸡粪厌氧发酵过程的影响。研究结果将有助于排除抗生素对厌氧发酵处理的障碍，避免和消除抗生素在厌氧发酵中的抑制作用，保证以鸡粪为原料的沼气工程正常运行。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验选用的发酵原料是新鲜鸡粪便，取自哈尔滨周边养殖场。接种物为上一次发酵后的消化液。

1.2 试验设计

1.2.1 试验装置设计和药品

实验装置采用1 000mL 锥形瓶作为厌氧发酵反应容器，发酵有效容积500mL，置于恒温水浴锅中，温度控制在55±1℃。发酵过程中产生气体通过导气管进入装有水的集气瓶中，以排水法收集。

实验药品：金霉素、土霉素和阿莫西林的纯度大于99%；甲醇、Na2HPO4、Na2EDTA、柠檬酸、三氯乙酸、草酸甲醇等。

1.2.2 试验方法设计

本实验设定发酵料液的TS为8%，发酵温度为55℃，接种物添加量为有效容积的30%。

抗生素含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)：选用不同浓度的标准工作液，以浓度(x)为横坐标，以相应峰面积(y)为纵坐标做回归分析，得到3种抗生素的标准曲线和相关系数。将待测样品的峰面积的平均值代入标准曲线，即可得出待测样品的含量。

单因素实验：根据原料固含量加水调节至发酵料液总固体含量为 8%，发酵温度为55±1℃，发酵周期20d，分别研究不同剂量的土霉素、金霉素和阿莫西林与产气率之间的变化关系，加量梯度为：0、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg。

正交实验：根据单因素实验结果，选定各因素的水平，对加土霉素、金霉素、阿莫西林三因素选用L9(34)表，研究抗生素联合作用的正交实验，正交因素水平见表1。

表1 正交因素实验水平表
Tab.1 Effect factors and their level on orthogonal test

水平因 素A土霉素含量mg·kg-1B土霉素含量mg·kg-1C土霉素含量mg·kg-11225255103101020

1.3 实验指标测定

酸碱度通过pH计测得，氨氮指标采用纳氏试剂分光光度法测定，具体方法参照国标法[10]。

2 结果与分析

本实验所采用的鸡粪的基本理化性质见表2。

表2 鸡粪基本理化性质
Tab.2 Physical and chemical properties of chicken manure

项目TS/%VS/%TOC/%TN/%C/NS/%P(P2O5)/%NH+4-N/mg·L-1鸡粪29.0219.8610.41.089.650.10.22530

添加抗生素后经HPLC测得抗生素终浓度见表3。

表3 抗生素终浓度
Tab.3 Antibiotics final concentration

土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1000222555101010202020

2.1 单因素试验结果及分析

A．土霉素含量对总产气量的影响结果。

图1 土霉素含量对总产气率的影响Fig.1 Accumulated methane production with the treatment of oxytetracycline

由上图可知，土霉素含量在0～5mg·kg-1，总产气量呈稳步升高趋势，土霉素含量达到5mg·kg-1时，得到最大产气量15.32L·kg-1。土霉素含量在5～20mg·kg-1时，总产气量下降，pH值也明显下降，土霉素含量达到20mg·kg-1时，pH值为6.3，这时反应器偏酸。

B.金霉素含量对总产气量的影响结果。

图2 金霉素含量对总产气量的影响Fig.2 Accumulated methane production with the treatment of chlortetracycline

由图2可知，金霉素含量在0～5mg·kg-1，总产气量平稳微有上升，金霉素含量达到5mg·kg-1时，得到最大产气量15.06L·kg-1。金霉素含量在5～20mg·kg-1时，总产气量下降，pH值也明显下降，土霉素含量达到20mg·kg-1时，pH值为6.2，反应器偏酸。

C.阿莫西林含量对总产气量的影响结果。

图3 阿莫西林含量对总产气量的影响Fig.3 Accumulated methane production with the treatment of amoxicillin

由图3可知，阿莫西林含量在0～10mg·kg-1，总产气量平稳微有上升趋势，阿莫西林含量达到10mg·kg-1时，得到最大产气量15.35L·kg-1。金霉素含量在10～20mg·kg-1时，总产气量下降，pH值也明显下降，土霉素含量达到20mg·kg-1时，pH值为6.3，偏酸。

综上所述，在本实验中抗生素浓度较低时，不会对微生物的活性有抑制，甚至低剂量的抗生素会促进一些酶类的产生从而促进产气；但是随着抗生素浓度的增加，过量的抗生素就会抑制产甲烷菌的活性从而使产气量下降。这和微生物自身性质、抗生素的浓度、与抗生素的接触时间等有关。而鸡粪中含有大量的碳水化合物为产酸菌提供了充足的并可以直接利用的营养，所以产酸菌大量繁殖，导致pH值偏低。

2.2 正交试验结果及分析

表4 正交实验方案及结果
Tab.4 The orthogonal test layout and results

实验号A土霉素/mg·kg-1B金霉素/mg·kg-1C阿莫西林/mg·kg-1e1总产气率/L·kg-111(2)1(2)1(5)18.62212(5)2(10)214.33313(10)3(20)312.9142(5)12313.765223115.776231213.7873(10)13212.378321314.069332114.71K135.85934.74936.45939.099K243.31144.16042.80140.479K341.13941.40041.04940.731k111.95311.58312.15313.033k214.43714.72014.26713.493k313.71313.80013.68313.577R2.4843.1372.1140.544优水平A2B2C2

由表4的极差分析可知，各因素对总产气率影响的大小顺序为B>A>C，即金霉素>土霉素>阿莫西林。最佳的因素水平组合为A2B2C3，即土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1。由表5的显著性分析可知，土霉素和金霉素对厌氧发酵的影响显著高于阿莫西林。这3种抗生素的按比例配合使用具有协同效果，在抑制畜禽体内有害微生物生长繁殖的同时不会降低产气量。金霉素和土霉素对细菌有着更强的作用，因此对发酵的影响也比较显著。

表5 正交实验显著性分析
Tab.5 Significance analysis of orthogonal test

因素偏差平方哈自由度F比F临界值显著性土霉素9.788219.04319.000*金霉素15.599230.34819.000*阿莫西林7.147213.90519.000误差0.512

3 结论

本实验选取了两类抗生素，即四环素类的土霉素和金霉素及β-内酰胺药物阿莫西林，通过HPLC测定这两类抗生素的不同浓度，通过单因素实验确定了正交试验的合理范围，进行以四环素类抗生素含量为2 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10mg·kg-1，阿莫西林含量为5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20mg·kg-1的正交实验，确定了在抗生素存在下厌氧发酵的最优因素水平为土霉素、金霉素含量分别为5mg·kg-1和阿莫西林含量为10mg·kg-1，这种组合不会对发酵产气产生抑制。

综上所述，研究抗生素对厌氧发酵的影响对进一步提高我国的畜禽粪便综合处理效率，实现沼气工程的工业化生产，必将带来明显的环境效益、经济效益和社会效益，以期能为以畜禽粪便作为发酵原料的大型沼气工程提供一定的基础参考数据和经验。

[1] 陈超，阮志勇，吴进，等.规模化沼气工程沼液综合处理与利用的研究进展[J].中国沼气，2013，31(1)：25-28，43.

[2] 徐秀银.规模化养猪场沼液的利用现状与对策[J].江苏农业学，2010，(06)：521-522.

[3] 陶秀萍，董红敏，尚斌. 新鲜猪沼液和牛沼液对农作物病原真菌抑制作用的比较研究[J].农业环境科学学报，2011，(07)：1443-1449.

[4] 杜丽芳，王艳，廖新俤，等.不同碳氮比和接种量对蛋鸡粪厌氧发酵氨氮抑制效应的影响[J].中国家禽，2014，12(36)：28-33.

[5] 金明均，申春玉.畜禽养殖中抗生素使用的现状及建议[J].养殖技术顾问，2014，(10)：268.

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[8] 张发旺，鸡蛋中土霉素/四环素/金霉素残留的HPLC检测方法的研究[D].郑州：河南农业大学，2008.

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[10] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].北京：中国环境科学社，2002.

Study on the impact of the antibiotics on fowl manure anaerobic fermentation

FAN Chao, WANG Xin, LIU Wei, GAO De-yu, SU Xiao-hong, QIN Guo-hui, LIU Xu-dan, WANG Yu-peng

(Science and Technology Incubation Center, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150090, China;Heilongjiang Energy and Environment Research Institute, Harbin 150090, China)

Anaerobic fermentation device is used for high-temperature anaerobic fermentation experiments under different type of antibiotics with fresh fowl manure, and the impact of the antibiotics on anaerobic fermentation to produce biogas is studied in this paper. The results showed that the addition of low concentration of antibiotic has no obvious inhibition on fermentation and the total air rate changes little under the single factor experiments; when the content of oxytetracycline and chlorotetracycline for more than 5mg·kg-1, at the same time, the content of amoxicillin for 10mg·kg-1, the total air rate decrease. Batch tests based on orthogonal test were adopted. Oxytetracycline, chlorotetracycline, amoxicillin which were the mostly common antibiotocs used in the treatment of chicken disease were chosen in the experiment. The results showed that the menthane production rate was affected mostly by the combination of 5mg·kg-1of oxytetracycline, 5mg·kg-1of chlorotetracycline 10mg·kg-1of amoxicillin.

Anaerobic fermentation; Antibiotics; Significance

2016-10-08

范超(1990-)，女，硕士，研究实习员。

S216.4；X713

A

1674-8646(2016)22-0001-04